Generierung postganglionärer sympathischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Nehmen Sie eine mit extrazellulärer Matrix beschichtete Mikroplatte und fügen Sie humane pluripotente Stammzellen hinzu, die in einem Differenzierungsmedium suspendiert sind.

Das Medium enthält Signalmoleküle, die zelluläre Signalwege beeinflussen und die Differenzierung in neurale Vorläuferzellen lenken.

Einführung eines weiteren Differenzierungsmediums, das Signalmoleküle enthält, die die Differenzierung in Neuralleistenzellen (NCCs) induzieren, Vorläufer neuronaler und nicht-neuronaler Zellen.

Fügen Sie Enzyme hinzu, um die Matrix zu stören und dadurch die Zellen zu dissoziieren.

Waschen, um die Enzyme zu neutralisieren, dann zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die NCCs in einem Sphäroidmedium und übertragen Sie sie auf eine Mikrotiterplatte.

Die Wachstumsfaktoren und kleinen Moleküle des Mediums induzieren die Bildung von Sphäroiden.

Ergänzung mit Retinsäure, die die Differenzierung in sympathische Vorläuferneuronen fördert.

Übertragen Sie das Sphäroid auf eine mit Adhäsionsprotein beschichtete Mikroplatte in einem sympathischen Neuronenreifungsmedium, wodurch eine Sphäroidbindung verursacht wird.

Neuronale Wachstumsfaktoren und Retinsäure im Medium fördern die Reifung zu postganglionären sympathischen Neuronen, die Teil des peripheren Nervensystems sind und unwillkürliche Prozesse regulieren.

Einen Tag vor der Differenzierungsinduktion beschichten Sie die entsprechende Anzahl von Sechs-Well-Platten mit zwei Millilitern Basalmembranmatrix pro Well und lagern Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen erwärmen Sie die Platten auf Raumtemperatur und waschen Sie die spaltbereite humane pluripotente Stammzellkultur zweimal mit frischem PBS pro Waschgang.

Behandeln Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen 15 Minuten lang mit sieben Millilitern 0,5 Millimolar EDTA im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die schwimmenden menschlichen pluripotenten Stammzellen aspirieren und die geernteten Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen.

Geben Sie ein gleiches Volumen PBS in das Röhrchen, um das EDTA zu verdünnen, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Differenzierungsmedium Tag 01. Bevor Sie ein geeignetes Volumen des Mediums für die Zählung hinzufügen, verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1,25 x 10⁵ Zellen pro Quadratzentimeter in zwei Millilitern Differenzierungsmedium pro Vertiefung.

Aspirieren Sie die gesamte Basalmembranmatrixlösung aus jeder Vertiefung der zuvor vorbereiteten Sechs-Well-Platte. Säen Sie dann 2 Milliliter Zellen in jede Vertiefung und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Füttern Sie die Zellen am nächsten Morgen mit 3 Millilitern Tag 01 Differenzierungsmedium pro Vertiefung.

Füttern Sie die Zellen am zweiten Tag der Differenzierung mit drei Millilitern Differenzierungsmedium für den zweiten bis zehnten Tag pro Vertiefung. Füttern Sie die Zellen dann jeden zweiten Tag bis zum 10. Tag. Um die Neuralleistenzellen zu Sphäroiden zu aggregieren, waschen Sie die Zellen am Tag 10 mit PBS und fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationsmedium zu jeder Vertiefung hinzu. Nach 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator werden die schwimmenden Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und das Volumen der Suspension im Röhrchen mit frischem PBS auf 50 Milliliter gebracht.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Sphäroidmedium für die Zählung an Tag 10 bis 14. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 5 x 10⁵ Zellen pro 500 Mikroliter unter Verwendung des Sphäroidmediums der Tage 10 bis 14 und plättieren Sie 500 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit extrem geringer Anhaftung. Anschließend werden die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator zurückgeführt.

Um eine minimale Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie die Neuralleisten-Sphäroide am Tag 11 der Kultur mit zusätzlichen 500 Mikrolitern Sphäroidmedium pro Tag 10 bis 14. Kippen Sie an Tag 12 die Platte, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte zu akkumulieren, und saugen Sie vorsichtig so viel Medium wie möglich aus jeder Vertiefung an, ohne Sphäroide zu aspirieren. Füttern Sie dann die Sphäroide mit einem Milliliter Sphäroid Medium Tag 10 bis 14 pro Vertiefung.

Um eine expandierte Sphäroidkultur am Tag 15 zu induzieren, füttern Sie die Sphäroide mit 1,5 Millilitern Sphäroidmedium für Tag 10 bis 14, das mit 0,5 mikromolare Retinsäure pro Vertiefung ergänzt wird. Geben Sie dann die Sphäroide wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück.

Für die Differenzierung sympathischer Neuronen an Tag 14 oder 28 kippen Sie die Platte, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte zu akkumulieren, und saugen Sie vorsichtig so viel Medium wie möglich an. Füttern Sie die Zellen mit einem Milliliter sympathischem Neuronenmedium.

Um große Sphäroidaggregate in kleinere Sphäroide aufzubrechen, fügen Sie nicht mehr als einen Milliliter Medium pro Vertiefung hinzu und pipettieren Sie die Sphäroide fünf bis 10 Mal, bevor Sie sie aufteilen.

Und entfernen Sie das überschüssige Lamininfibronektin von zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten. Teilen Sie die Platte, einen Milliliter Sphäroide aus jeder Vertiefung auf der 24-Well-Sphäroidkulturplatte, auf vier separate Vertiefungen der neu beschichteten 24-Well-Platte auf. Geben Sie 250 Mikroliter frisches sympathisches Neuronenmedium in jede Vertiefung und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Medium in jeder Vertiefung durch einen Milliliter sympathisches Neuronenmedium, das mit 0,125 mikromolare Retinsäure ergänzt ist, und stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator. Füttern Sie die Neuronen nach dem 35. Tag, indem Sie vorsichtig nur die Hälfte des vorhandenen Mediums in jeder Vertiefung durch frisches Medium ersetzen.