Eine Co-Kulturtechnik zur Differenzierung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen in Neuronen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:14 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Kultur von menschlichen neuralen Vorläuferzellen (NPCs), die auf einer extrazellulären Matrix gestützt sind.
Die NPCs sind so konstruiert, dass sie ein fluoreszierendes Protein exprimieren.
Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen, um alle Medienreste zu entfernen.
Inkubieren Sie die Kultur mit Enzymen, die die Matrix aufbrechen und die Zellen dissoziieren.
Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein Röhrchen und fügen Sie ein Medium hinzu, um die enzymatische Wirkung zu neutralisieren.
Zentrifugen, um die Zellen zu pelletieren, den Überstand zu verwerfen und die NPCs in einem neuronalen Differenzierungsmedium zu resuspendieren.
Übertragen Sie die NPCs auf eine etablierte Co-Kultur von Maus-Astrozyten und kortikalen Neuronen der Ratte.
Wachstumsfaktoren, die durch die etablierte Co-Kultur freigesetzt werden, fördern zusammen mit den Zell-Zell-Kontakten der NPCs mit den kortikalen Neuronen und Astrozyten die Differenzierung der NPCs in reife Neuronen.
Die reifen Neuronen zeigen ausgedehnte zelluläre Prozesse und bilden synaptische Verbindungen.
Verwenden Sie unter einem konfokalen Mikroskop das Signal der fluoreszierenden Proteine, um die menschlichen NPC-abgeleiteten Neuronen sichtbar zu machen.
Nach der Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSCs werden die Zellen als humane neurale Vorläuferzelle oder NPC-Kultur gemäß dem Textprotokoll induziert und aufrechterhalten. In diesem Beispiel werden die NPCs mit dem lentiviralen Vektor Synapsin1-tdTomato markiert. Verwenden Sie am Tag nach dem Hinzufügen von primären Neuronen zu einer Astrozytenkultur 1X PBS, um menschliche NPCs einmal zu waschen. Fügen Sie dann die Lösung zur Zellablösung hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen abgelöst haben, geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der doppelten Menge an DMEM/F12 und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 200 g. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie ein neuronales Differenzierungsmedium, um das Pellet sanft in einzelne Zellen zu resuspendieren. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.
Als nächstes aspirieren Sie vorsichtig das Medium aus den kortikalen Neuronenkulturen der Astrozyten. Plattieren Sie die menschlichen NPCs mit 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter pro Vertiefung in neuronalem Differenzierungsmedium. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 und tauschen Sie das Medium mindestens 28 Tage lang alle zwei bis drei Tage aus.
Um zu bestätigen, ob sich menschliche iPSCs wie ausgereifte Neuronen verhalten, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit einer 60-fachen Wasserimmersionslinse ausgestattet ist. Suche nach Zellen, die sich von menschlichen iPSCs unterscheiden, durch Visualisierung von tdTomato.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Differenzierung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (NPCs) in reife Neuronen unter Verwendung eines Kokultursystems mit Mausastrozyten und Rattenkortikalneuronen. Die NPCs sind so konstruiert, dass sie ein fluoreszierendes Protein exprimieren, das eine Visualisierung im konfokalen Mikroskop ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Stammzellforschung
Hintergrund
- Menschliche neurale Vorläuferzellen (NPCs) können sich in Neuronen differenzieren.
- Kokultursysteme können die neuronale Differenzierung fördern.
- Fluoreszierende Proteine ermöglichen die Visualisierung differenzierter Zellen.
- Das Verständnis der NPC-Differenzierung ist entscheidend für die regenerative Medizin.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Differenzierung von NPCs in reife Neuronen etablieren.
- Den Differenzierungsprozess mithilfe fluoreszierender Marker sichtbar machen.
- Die Wechselwirkungen zwischen NPCs und etablierten neuronalen Kulturen untersuchen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung menschlicher NPCs auf einer extrazellulären Matrix.
- Enzymatische Dissoziation der NPCs von der Matrix.
- Kokultivierung mit Maus-Astrozyten und Ratten-Kortexneuronen.
- Anwendung der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung differenzierter Neuronen.
Hauptergebnisse
- NPCs differenzierten sich erfolgreich in reife Neuronen.
- Reife Neuronen wiesen ausgeprägte Fortsätze und synaptische Verbindungen auf.
- Die Fluoreszenzbildgebung bestätigte das Vorhandensein differenzierter Neuronen.
- Das Kokultursystem förderte effektiv die neuronale Reifung.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung der neuronalen Differenzierung.
- Die Kokultur mit Astrozyten und kortikalen Neuronen fördert die Reifung von NPCs.
- Fluoreszenzmarker eignen sich gut zum Verfolgen der Differenzierung.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Differenzierung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen in funktionelle Neuronen ist ein entscheidender Schritt bei der Zielvalidierung für Modelle neurodegenerativer Erkrankungen. Diese Co-Kultur-Technik erhöht die Vorhersagesicherheit, indem sie ein krankheitsrelevantes System bereitstellt, das die mechanistische Risikominderung therapeutischer Hypothesen unterstützt. Der Ansatz ermöglicht die skalierbare Herstellung validierter neuronaler Phänotypen für die Entwicklung nachgeschalteter Assays und Screening-Kampagnen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Differenzierung menschlicher NPCs in Neuronen in einem physiologisch relevanten Mikromilieu.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur funktionellen Target-Validierung unter Verwendung fluoreszenzmarkierter menschlicher NPCs.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem krankheitsrelevante Neuronen erzeugt werden, die reife Phänotypen aufweisen, einschließlich langer Fortsätze und synaptischer Verbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt differenzierte humane Neuronen, die für quantitative, bildbasierte Assays mittels konfokaler Mikroskopie geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Co-Kultur-Bedingungen mit murinen Astrozyten und kortikalen Neuronen von Ratten fördern eine konsistente Differenzierung von NPCs über verschiedene Experimente hinweg.
- Skalierbarkeit: Das Protokoll ermöglicht das Ansäen bei definierten Dichten (5.000 Zellen/cm²) und damit die Anpassung an Mehrfach-Plattenformate für Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Erzeugt aus menschlichen Zellen stammende Neuronen, die die Biologie des Nervensystems modellieren und die translationale Erforschung von Biomarkern unterstützen.
- Präklinische Kontinuität: Differenzierte Neuronen behalten mindestens 28 Tage lang ihre Vitalität, wodurch Langzeitstudien zur neuronalen Reifung und Funktion ermöglicht werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Die fluoreszenzbasierte Verfolgung mittels tdTomato ermöglicht eine nichtinvasive Überwachung der Differenzierungseffizienz und verringert die Variabilität bei präklinischen Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Generierung von aus Stammzellen abgeleiteten NPCs bis hin zu funktionellen neuronalen Assays ein und unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen durch phänotypische Bildschirmung der Wirkstoffeffekte auf Reifung und Vernetzung.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft Hypothesen zu extrinsischen Signalen von Astrozyten und kortikalen Neuronen, die die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen und die neuronale Reifung steuern.
- Screening: Bereitstellung standardisierter neuronaler Kulturen mit fluoreszenten Nachweisen für die automatisierte oder hochinhaltsbasierte Bildgebung von verbindungsinduzierten Veränderungen im Neuritauswuchs oder in der Synapsenbildung.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen wie Prozesslänge, Fluoreszenzintensität und Ko-Lokalisation prä- und postsynaptischer Marker mittels konfokaler Mikroskopie.
- Translationale Forschung: Nutzung menschlicher, aus iPSCs abgeleiteter neuronaler Vorläuferzellen, um die Speziesrelevanz in präklinischen Modellen neurologischer Erkrankungen zu erhöhen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schaffung einer wiederverwendbaren Plattform für neuronale Differenzierung, die auf verschiedene Zielklassen und therapeutische Bereiche in der Neurowissenschaft anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in neuronalen Differenzierungswegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch definierte Schritte der Dissoziation, Platten und Mediumwechsel über einen Differenzierungszeitraum von 28 Tagen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitige phänotypische Aussagen zur neuronalen Reifung und Vernetzung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf Effekten in einem humanen Neuronen-Kokultursystem.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Stammzellkultur, enzymatischen Dissoziation und fluoreszierenden Mikroskopie.
- Setzt den Zugang zu einer konfokalen Mikroskopie mit geeigneten Filterblöcken für die Detektion von tdTomato voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Co-Kulturpflege, einschließlich des Astrozyt-Neuron-Verhältnisses und der Häufigkeit des Mediumwechsels.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel zu verschiedenen humanen iPSC-Linien oder Beschichtungen der extrazellulären Matrix.
- Ist durch die xenogene Natur der Maus-Astrozyt-Ratte-Neuron-Füttererschicht begrenzt, die die Reifungskinetik humaner Neuronen beeinflussen könnte.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026