Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Beginnen Sie mit einem MOE-Mikrofluidik-Chip, der an eine Stromversorgung angeschlossen ist.

Der Chip enthält Poly-L-Lysin-beschichtete Kulturregionen, die mit Ein- und Auslassöffnungen verbunden sind, sowie montierte Ag/AgCl-Elektroden für elektrische Verbindungen.

Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf einer Heizung, um optimale Wachstumsbedingungen zu erzielen.

die Auslässe fließen neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) in die beschichteten Kulturregionen ein.

Die Zellen interagieren elektrostatisch mit dem Poly-L-Lysin und haften an der mikrofluidischen Vorrichtung.

Führen Sie als nächstes ein Wachstumsmedium ein, das Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation der anhaftenden Zellen erleichtern.

Anlegen eines elektrischen Stroms über die Ag/AgCl-Elektroden für eine längere Dauer mit kontinuierlicher Zufuhr von Medium für die Lebensfähigkeit der Zelle.

Der elektrische Strom regt NPCs an und aktiviert sie und fördert so die Ausdehnung neuronaler Prozesse aus den Zellkörpern.

Darüber hinaus löst die elektrische Stimulation verschiedene intrazelluläre Signalwege aus.

Diese Signalwege fördern die Differenzierung von NPCs spezifisch in verschiedene Nervenzellen wie Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.

Zeichnen Sie zunächst Muster für einzelne PMMA-Schichten und doppelseitiges Klebeband mit einer geeigneten Software. Schalten Sie den Kohlendioxid-Laserritzer ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die Designmusterdatei mit der Software.

Legen Sie die PMMA-Platten oder das doppelseitige Klebeband auf die Plattform des Laserritzers. Fokussieren Sie dann den Laser mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder des doppelseitigen Klebebandes. Wählen Sie den Laserritzer als Drucker aus. Verwenden Sie dann den Laserritzer, um die direkte Ablation auf der PMMA-Platte oder dem doppelseitigen Klebeband zu starten.

Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. Um mehrere Schichten von PMMA-Platten miteinander zu verkleben, stapeln Sie drei Stücke 1-Millimeter-PMMA-Platten und kleben Sie sie unter einem Druck von 5 Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bonder für 30 Minuten bei 110 Grad Celsius zu der Strömungs- oder elektrischen Stimulationskanalanordnung. Kleben Sie 12 Stück Adapter mit schnellwirkendem Cyanacrylatkleber auf die einzelnen Öffnungen in der ersten Schicht der MOE-Chip-Baugruppe.

Desinfizieren Sie die 1-Millimeter-PMMA-Substrate, das doppelseitige Klebeband und das 3-Millimeter-PMMA in optischer Qualität 30 Minuten lang mit ultravioletter Bestrahlung, bevor Sie den Chip zusammenbauen. Kleben Sie die 1-Millimeter-PMMA-Substrate mit dem doppelseitigen Klebeband auf das 3-Millimeter-PMMA in optischer Qualität, um die PMMA-Montage abzuschließen. Kleben Sie das gereinigte Deckglas mit dem doppelseitigen Klebeband auf die PMMA-Baugruppe.

Verschließen Sie die Öffnungen der Agarbrückenadapter mit weißen, fingerfesten Steckern. Verbinden Sie den Flachstecker über die Einlass- und Auslassadapter des Mediums mit der MOE-Chipbaugruppe. Verbinden Sie dann den Konus-Luer-Adapter mit den Dreiwege-Absperrhähnen. Fügen Sie 2 Milliliter 0,01%ige PLL-Lösung mit einer 3-Milliliter-Spritze hinzu, die mit dem Dreiwege-Absperrhahn des Mediumeinlasses verbunden ist, und schließen Sie eine leere 3-Milliliter-Spritze mit dem Dreiwege-Absperrhahn des Mediumauslasses an.

Füllen Sie die Zellkulturregionen mit der PLL-Lösung und pumpen Sie die Beschichtungslösung langsam hin und her. Schließen Sie die beiden Dreiwege-Absperrhähne, um die Lösung in den Kulturbereichen zu verschließen. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxidatmosphäre gefüllt ist. Öffnen Sie die beiden Dreiwege-Absperrhähne und spülen Sie die Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell im Kanal hin und her pumpen.

Ziehen Sie 3 Milliliter des vollständigen Mediums in eine 3-Milliliter-Spritze, die mit dem Drei-Wege-Absperrhahn des Mediumeinlasses verbunden ist, und fügen Sie es hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Ersetzen Sie den weißen fingerfesten Stopfen durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3 % heiße Agarose, um den Adapter zu füllen. Verbinden Sie die Luer-Lock-Spritze mit dem Luer-Adapter und injizieren Sie 3 % heiße Agarose durch den schwarzen Gummistopfen zum Befüllen der Luer-Lock-Spritze. Lassen Sie die Agarose 10 bis 20 Minuten abkühlen und fest werden.

Installieren Sie den Cell-Seeding-MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einem programmierbaren XYZ-Motor befestigt ist, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Infundiere die mNPCs, indem du sie manuell über den Mediumauslass in den MOE-Chip pumpst. Inkubieren Sie dann den zellbesiedelten MOE-Chip 4 Stunden lang auf der ITO-Heizung.

Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um Rechteck-Gleichstromimpulse auszugeben.