Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen mit einem mikrofluidischen Gerät

Beginnen Sie mit einem polymerbeschichteten mikrofluidischen Gerät mit miteinander verbundenen Vertiefungen, die verspiegelte Kompartimente tragen, die über Mikrorillen verbunden sind.

Säen Sie neurale Vorläuferzellen in die Vertiefungen eines Kompartiments.

Lassen Sie sie in den miteinander verbundenen Kanal wandern und haften Sie am Polymer.

Überlagern Sie es mit einem Wachstumsmedium, um die neuronale Reifung zu Motoneuronen zu fördern.

Im gegenüberliegenden Kompartiment säen Sie die Vertiefungen mit Muskelvorläuferzellen, die wandern und an den miteinander verbundenen Kanal haften.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Differenzierungsmedium, das die Fusion von Muskelvorläuferzellen induziert und mehrkernige Muskelzellen bildet.

Fügen Sie dem Muskelzell-haltigen Kompartiment ein Neuronendifferenzierungsmedium hinzu, das Wachstumsfaktoren enthält.

In der Zwischenzeit fügen Sie dem neuronalen Zell-haltigen Kompartiment ein halbes Volumen wachstumsfaktorfreies Medium hinzu.

Die Wachstumsfaktoren und ein höheres Volumen des Mediums im gegenüberliegenden Kompartiment veranlassen die Motoneuronen, ihre Fortsätze durch die Mikrorillen auszudehnen.

Diese neuronalen Prozesse verbinden sich dann mit den Muskelzellen und bilden neuromuskuläre Verbindungen.

Um die neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in dem mikrofluidischen Gerät zu plattieren, entfernen Sie DPBS mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus zwei Vertiefungen auf einer Seite der Mikrorillen im Gerät. Um insgesamt 250.000 NPCs in 60 bis 100 Mikroliter Tag 10 Motoneuronenmedium pro Gerät in der oberen rechten Vertiefung zu säen, säen Sie die Hälfte der Zellsuspension in der Nähe der Kanalöffnung in einem Winkel von 45 Grad.

Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die restliche Hälfte der Zellsuspension in die untere Vertiefung geben. Verwenden Sie einen Stift, um die ausgesäte Seite als NPC oder gleichwertig zu markieren, um das Gerät ohne Mikroskop leicht zu orientieren, und inkubieren Sie fünf Minuten lang für die Zellanhaftung. Füllen Sie als Nächstes die beiden mit NPC gesäten Vertiefungen langsam mit einem zusätzlichen Tag 10 Motoneuronenmedium auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung auf. Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette DPBS aus den beiden Vertiefungen auf der anderen Seite der Mikrorillen, die den frisch ausgesäten NPCs gegenüberliegen.

Geben Sie 200 Mikroliter Motoneuronen-Medium am Tag 10 pro Vertiefung in die nicht besiedelten Vertiefungen. Geben Sie dann 6 Milliliter DPBS pro 10-Zentimeter-Schale um das Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums während der Inkubation zu verhindern.

Um das Medium zu wechseln, entfernen Sie langsam das Medium in beiden Vertiefungen mit NPCs, indem Sie die 200-Mikroliter-Pipettenspitze am unteren Rand der Well-Wand gegenüber der Kanalöffnung positionieren. Um zu verhindern, dass ein starker Medienfluss die Zellen im Kanal schädigt, fügen Sie langsam 50 bis 100 Mikroliter frisches Motoneuronenmedium in jede Vertiefung hinzu, indem Sie kontinuierlich zwischen der oberen und unteren Vertiefung wechseln. Wiederholen Sie den Vorgang, bis jede Vertiefung 200 Mikroliter Medium enthält.

Am 17. Tag der Motoneurondifferenzierung entfernen Sie das Motoneuronmedium auf der nicht besiedelten Seite der Mikrorillen im Gerät mit einer 200-Mikroliter-Pipette und waschen Sie die Vertiefungen mit DPBS. Säen Sie insgesamt 200.000 humane primäre Mesoangioblasten oder MABs in 60 bis 100 Mikroliter Wachstumsmedium pro Gerät aus, indem Sie die Hälfte der Zellsuspension in die obere Vertiefung säen.

Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die verbleibende Hälfte der Zellsuspension in die Vertiefung des Bodens aussäen, wie zuvor für die Beschichtung von NPCs gezeigt. Inkubieren Sie das Gerät fünf Minuten lang, um die Zellen zu adhäsieren. Füllen Sie dann die beiden frisch mit MAB gesäten Vertiefungen mit einem zusätzlichen Wachstumsmedium auf und inkubieren Sie erneut wie gezeigt.

Um den chemotaktischen und volumetrischen Gradienten am 21. Tag der Motoneurondifferenzierung zu initiieren, fügen Sie dem Myotubus-Kompartiment 200 Mikroliter pro Vertiefung des Motoneuron-Basalmediums hinzu, das Wachstumsfaktoren enthält. Geben Sie dann 100 Mikroliter pro Vertiefung des Motoneuron-Basalmediums ohne Wachstumsfaktoren in das Motoneuron-Kompartiment.