Eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kulturtechnik zur Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die einen permeablen Membraneinsatz enthält, der mit Poly-D-Lysin beschichtet ist.

Geben Sie Astrozyten-Wachstumsmedium in die Vertiefung und säen Sie Astrozyten, eine spezialisierte Gliazelle, in den Einsatz ein.

Inkubieren, um die Zelladhärenz an Poly-D-Lysin über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen und eine Monoschicht zu bilden.

Ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch ein Neuronenkulturmedium.

Übertragen Sie diesen Einsatz in eine Multi-Well-Platte, die anhaftende primäre embryonale Mausneuronen über einem polymerbeschichteten Deckglas enthält.

Inkubieren Sie, um eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kultur zu etablieren, bei der die beiden Zelltypen physisch getrennt sind und sich jedoch das gleiche Kulturmedium teilen.

Astrozyten sezernieren verschiedene neurotrophe Faktoren, die für das Überleben und Wachstum von Neuronen unerlässlich sind.

Diese Faktoren wandern durch die permeable Unterstützung und interagieren mit primären Neuronen. Dies fördert ihre Differenzierung und bildet neuronale Projektionen.

Diese Projektionen verlängern sich und stellen synaptische Verbindungen zwischen Neuronen her, was auf Neuron-Glia-Interaktionen hinweist.

Jede Einlage wird mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysin bestreut und eine Stunde lang inkubiert. Waschen Sie die Einlagen nach einer Stunde zweimal mit PBS.

In der Zwischenzeit das Astrozytenmedium aspirieren und die Kultur einmal mit 10 Millilitern PBS waschen, um sicherzustellen, dass das restliche Serum entfernt wird. Geben Sie anschließend 3 Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA in die Kolben und inkubieren Sie die Zellen für die Trypsinisierung für etwa 10 Minuten. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 7 Millilitern Astrozytenmedium.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 216 μg. Aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter Astrozytenmedium. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Füllen Sie anschließend die 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Astrozytenmedium pro Well. Aspirieren Sie das PBS und übertragen Sie 25.000 Zellen in 500 Mikrolitern Astrozytenmedium in jedes einzelne Insert, und inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius.

Um die Hippocampi zu sezieren, bereiten Sie drei 10-Zentimeter-Schalen mit Zubereitungsmedium und eine 2-Milliliter-Tube mit 1 Milliliter Zubereitungsmedium vor. Präparieren Sie die Hippocampi aus den Kortex-Einheiten und sammeln Sie sie in einem 2-Milliliter-Röhrchen, das mit Präparationsmedium gefüllt ist.

Es ist wichtig, dass die Hippocampi ohne angrenzendes Gewebe aus anderen Regionen des ZNS isoliert werden. Daher muss nach der Entfernung des Hippocampus zusätzlich das fremde Kontaminationsgewebe entfernt werden.

Übertragen Sie das Röhrchen nach der Dissektion auf eine sterile Laminar-Flow-Bank. Entfernen Sie das Präparationsmedium vorsichtig und verdauen Sie das Hippocampusgewebe mit 1 Milliliter Verdauungslösung, die Papain enthält. Nach 15 Minuten Aufschluss ziehen Sie die Aufschlusslösung vorsichtig durch sanftes Ansaugen mit einer Pipette heraus.

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Neurons ist es wichtig, die Hippocampus sorgfältig zu zerreiben, um Blasen zu vermeiden und die optimale Verreibungsintensität zu erreichen.

Waschen Sie den Hippocampi dreimal mit Neuronenmedium, indem Sie pro Waschgang 1 Milliliter frisches Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig aspirieren. Nach dem letzten Waschschritt zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig in 1 Milliliter Neuronenmedium. Zählen Sie dann die Zellen mit einer Zählkammer. Platten Sie 35.000 Zellen in 500 Mikroliter Neuronenmedium pro Vertiefung der 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie nun die vorbereiteten Inserts, die mit konfluenten Astrozyten-Monoschichten besiedelt wurden, aus dem Inkubator. Tauschen Sie das Medium aus, indem Sie das Astrozytenmedium aspirieren und durch 500 Mikroliter frisches Neuronenmedium ersetzen.

Platzieren Sie dann die Einsätze mit den Astrozyten vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen, in denen sich die Neuronenkulturen befinden. Platzieren Sie anschließend die resultierende indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kultur bis zu den Experimenten wieder in den Inkubator.