Isolierung und Kultur von primären Neuronen und Gliazellen aus einer Harnblase von Ratten

Nehmen wir eine euthanasierte Ratte.

Öffnen Sie den Bauch, schneiden Sie die Blase heraus und tauchen Sie sie in Puffer.

Schneiden Sie die Blase auf und entfernen Sie anhaftendes Fett und Gewebereste.

Übertragen Sie die Blase in ein Röhrchen mit Puffer, zentrifugieren Sie und entfernen Sie die Ablagerungen.

Legen Sie das Gewebe in eine Lösung, die Kollagenase enthält, und hacken Sie es. Fügen Sie mehr Kollagenase hinzu, um die extrazelluläre Matrix abzubauen und die Zellen zu lockern.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie Trypsin hinzu, um die Zell-Zell-Verbindungen zu stören und die Zellen freizusetzen.

Spülmedium mit Proteinen zur Inaktivierung von Trypsin hinzufügen, dann zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in Medien, filtern Sie sie, um Aggregate zu entfernen, und erhalten Sie eine einzellige Suspension.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in Medien.

Plattieren Sie die Zellen auf beschichteten Deckgläsern, um die Anheftung von neuronalen und glialen Zellen zu erleichtern. Entfernen Sie die nicht angehängten Zellen.

Fügen Sie Neuronenmedien hinzu, die Wachstumsfaktoren enthalten, um die Zellreifung zu fördern und eine primäre neuronale und gliale Kultur zu etablieren.

Beginnen Sie damit, Ratten auf ein sterilisiertes chirurgisches Handtuch zu legen und den Bauch freizulegen. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Blase freizulegen. Heben Sie die Blase mit einer weiteren Schere und Pinzette vorsichtig an und schneiden Sie sie vom Blasenhals ab.

Legen Sie die Blase dann schnell in kalte, sauerstoffstabile Krebslösung, um das Überleben der Zellen zu verbessern. Die Krebslösung in drei Glasschalen und drei Glasbecher geben und zum Vorkühlen in ein Eisbad stellen. Nummerieren Sie die Schalen und Becher 1, 2 und 3, um Verwechslungen zu vermeiden.

In der Glasschale 1 öffnen Sie die Blase mit einer Augenschere und entfalten sie mit einer Pinzette und einem Löffel Zellkernteiler. Spülen Sie die Blase im Becherglas 1 aus und legen Sie sie in die Glasschale 2. Entfernen Sie anhaftendes Fett auf der Gewebeoberfläche mit der Pinzette und der Augenschere. Spülen Sie dann die Blase in Becherglas 2 aus und legen Sie sie in Schale 3.

Kratzen Sie die Blase vorsichtig mit der Pinzette und dem Zellkernteiler des Löffels ab, um exogene Anhaftungen zu entfernen. Spülen Sie die Blase im Becherglas 3 aus und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 14 Millilitern kalter Krebslösung. Die Probe wird 1 Minute lang bei 360 mal g und 4 Grad Celsius zentrifugiert.

Übertragen Sie die Blase aus dem Zentrifugenröhrchen in ein 2-Milliliter-Fläschchen mit 1 Milliliter Aufschlusslösung. Schneide die Blase mit einer Augenschere in kleine Stücke. Mischen Sie die Blasenlösung mit 9 Millilitern Aufschlusslösung 1 in einer sterilen Zellkulturschale. Führen Sie den ersten Aufschluss in einem Schüttelbrutschrank für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bei 200 U/min durch. Nach dem ersten Aufschluss zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 mal g und 4 Grad Celsius für 8 Minuten.

In der Zwischenzeit die Aufschlusslösung 2 zum Vorwärmen in ein 37 Grad heißes Wasserbad geben. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den größten Teil des Überstands, der Aufschlusslösung 1 enthält, und lassen Sie etwas Überstand übrig, um Zellverlust zu vermeiden.

Suspendieren Sie die Zellen in warmer Verdauungslösung 2 und schütteln Sie die Mischung während der Verdauung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 5 Minuten. Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, deaktivieren Sie sofort das Trypsin, indem Sie 10 Milliliter kaltes Spülmedium hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 360 mal g und 4 Grad Celsius für 8 Minuten. Entfernen Sie dann so viel Überstand wie möglich, um das gesamte Trypsin zu eliminieren.

Sediment vorsichtig mit 3 Millilitern Neuronenmedium resuspendieren und darauf achten, dass keine Luftblasen in der Lösung entstehen. Die Suspension wird durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen filtriert. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 360 mal g bei 4 Grad Celsius für 8 Minuten. Suspendieren Sie dann die Zellpellets vorsichtig in 1 Milliliter Neuronenmedium A und geben Sie 500 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte. Kultivieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.