Kompartimentierte primäre murine Neuronenkultur mit mikrofluidischen Kunststoffchips

Nehmen wir einen mikrofluidischen Kunststoffchip, der aus somatischen Reservoiren und Kompartimenten sowie axonalen Reservoiren und Kompartimenten besteht, die durch Mikrorillen verbunden sind.

Fügen Sie eine Vorbeschichtungslösung hinzu, um die Kammern und Rillen zu sättigen und das Einschließen von Luftblasen zu verhindern.

Saugen Sie die Lösung an, wobei die Hauptfächer gefüllt bleiben. Mit Puffer waschen.

Beschichten Sie die Vertiefungen mit einem synthetischen Polymer, das die neuronale Adhäsion erleichtert. Mit Puffer waschen und Nährmedien hinzufügen, um ein Austrocknen des Chips zu verhindern.

Um eine Suspension von Hippocampus-Neuronen der Ratte zu säen, aspirieren Sie das Medium.

Laden Sie die Suspension in die somatischen Behälter. Die Neuronen dringen in das somatische Kompartiment ein und heften sich daran.

Geben Sie neuronale Nährmedien in die Vertiefungen und inkubieren Sie. Wachstumsfaktoren, die in den Medien vorhanden sind, erleichtern das neuronale Wachstum.

Nach und nach verlängern die Neuronen ihre Axone, die durch die Mikrorillen in das axonale Kompartiment hineinwachsen.

Die Enge der Rillen verhindert das Eindringen von neuronalen Zellkörpern und gewährleistet so die physikalische Trennung von somatischen und axonalen Regionen.

Legen Sie zunächst einen sterilen Chip mit mehreren Kompartimenten in eine Petrischale. Geben Sie 100 Mikroliter einer Anschwemmungslösung in die obere linke Vertiefung des Chips und lassen Sie sie durch den Hauptkanal in die angrenzende Vertiefung fließen. Füllen Sie anschließend die untere linke Vertiefung des Chips mit 100 Mikrolitern der Anschwemmlösung.

Warten Sie dieses Mal fünf Minuten, damit die Lösung durch die Mikrorillen fließen kann. Geben Sie nun 100 Mikroliter der Anschwemmlösung in die obere rechte Vertiefung und lassen Sie sie durch den Hauptkanal in die angrenzende Vertiefung fließen. Füllen Sie nach 90 Sekunden die untere rechte Vertiefung mit 100 Mikrolitern der Anschwemmungslösung und inkubieren Sie den Chip 10 Minuten lang.

Winkeln Sie die Pipettenspitze vorsichtig vom Hauptkanal weg ab und saugen Sie die Lösung aus jeder Vertiefung an. Geben Sie dann sofort 150 Mikroliter PBS in die obere linke Vertiefung und warten Sie 1,5 Minuten. Geben Sie als Nächstes 150 Mikroliter PBS in die untere linke Vertiefung und warten Sie fünf Minuten, bis die Flüssigkeit durch die Mikrorillen fließen kann.

Geben Sie dann 150 Mikroliter PBS in dieser Reihenfolge in die obere rechte und untere rechte Vertiefung. Nach 10 Minuten aspirieren Sie das PBS erneut und wiederholen die Waschschritte ein zweites Mal. Nach dem zweiten Waschgang aspirieren Sie das PBS wie zuvor, indem Sie die Pipettenspitze von der Kanalöffnung wegwinkeln.

Geben Sie dann 100 Mikroliter 0,5 mg Poly-D-Lysinlösung pro ml in die obere linke Vertiefung des Chips. Warten Sie 1 1/2 Minuten und füllen Sie dann die untere linke Vertiefung mit 100 Mikrolitern der Poly-D-Lysin-Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der rechten Hälfte des Chips. Schließen Sie die Petrischale und legen Sie den Chip für eine Stunde in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie den Chip nach der Inkubation zweimal mit PBS, wie zuvor beschrieben. Saugen Sie als Nächstes das PBS aus dem Gerät an. Geben Sie sofort 100 Mikroliter Zellkulturmedium in die obere linke Vertiefung des Chips. Fügen Sie nach 1 1/2 Minuten das Medium in die vertiefte Vertiefung unten links ein.

Warten Sie fünf Minuten, bis das Medium durch die Mikrorillen fließen kann, und wiederholen Sie dann den Füllvorgang auf der rechten Seite des Chips. Bereiten Sie eine Zellsuspension von dissoziierten Hippocampus-Neuronen der Ratte gemäß den etablierten Protokollen vor. Entfernen Sie den Großteil des Mediums in jeder Vertiefung des Chips, aber lassen Sie die Kanäle gefüllt.

Laden Sie anschließend sofort 5 Mikroliter der Zellsuspension in die obere rechte Vertiefung und weitere 5 Mikroliter Zellsuspension in die untere rechte Vertiefung. Richten Sie beim Beladen der Zellen die Spitze der Pipette auf den Hauptkanal. Nachdem Sie die Zellen geladen haben, übertragen Sie den Chip auf einen Mikroskoptisch, um sicherzustellen, dass sich die Neuronen im Hauptkanal befinden.

Nachdem Sie 5 Minuten gewartet haben, bis sich die Zellen anheften, fügen Sie jeweils etwa 150 Mikroliter neuronale Kulturmedien in die obere und untere rechte Vertiefung hinzu. Geben Sie dann jeweils 150 Mikroliter Medium in die obere und untere linke Vertiefung. Decken Sie die Petrischale ab und legen Sie den Chip in eine befeuchtete Schale in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.