Direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten in Neuronen

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit genetisch veränderten Astrozyten. Diese Zellen werden auf ein Deckglas geklebt, das in ein Astrozytenmedium gelegt wird.

Diese genetisch veränderten Zellen exprimieren Transformationsfaktoren, die ihren Übergang in Neuronen erzwingen. Dieser Prozess wird als neuronale Reprogrammierung bezeichnet.

Nehmen Sie ein neuronales Differenzierungsmedium, das bestimmte Moleküle und das B27-Präparat enthält. Zusammen liefern diese Komponenten essentielle Nährstoffe und Faktoren für die Differenzierung.

Ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch das neuronale Differenzierungsmedium.

Inkubieren Sie die Astrozyten für eine bestimmte Dauer.

Während der Inkubation lösen die von den Astrozyten exprimierten Transformationsfaktoren eine Abfolge von molekularen Ereignissen aus, die die Umwandlung eines Astrozyten in ein Neuron ermöglichen.

Umgewandelte Neuronen haben kleinere Zellkörper und längliche Prozesse, ähnlich wie typische Neuronen.

Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium vor, indem Sie einen Milliliter B27-Zusatz zu 49 Millilitern Basiskulturmedium hinzufügen. Nach 24 bis 48 Stunden, je nachdem, ob die Zellen transduziert oder transfiziert wurden, ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch ein Milliliter neuronales Differenzierungsmedium pro Well. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 9% Kohlendioxid.

Um die Reprogrammierungseffizienz zu erhöhen, ergänzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Forskolin und Dorsomorphin bis zu einer Endkonzentration von 30 Mikromolaren bzw. einem Mikromolaren, wenn Sie das Astrozytenmedium durch das Differenzierungsmedium ersetzen. Wenn Sie sich für die Behandlung von Zellen mit Forskolin und Dorsomorphin entscheiden, geben Sie zwei Tage nach der Erstbehandlung eine zweite Dosis Dorsomorphin. Geben Sie diese zweite Behandlung direkt auf das Kulturmedium.