Vorbereiten von Keilhirnschnitten zur Visualisierung auditiver Neuronen

Beginnen Sie mit einem Mäusegehirn und zerlegen Sie es horizontal unterhalb des hinteren Teils, um die für die Klangverarbeitung wichtigen auditorischen Neuronen zu erhalten.

Montieren Sie den hinteren Teil auf einer magnetischen Scheibe und platzieren Sie einen Agarblock, um das Gewebe während des Schneidens zu stabilisieren.

Übertragen Sie den Abschnitt auf die Bühne einer Schneidekammer eines Vibratoms, das mit einer Klinge ausgestattet ist.

Führen Sie einen kalten Puffer und ein Blasengas ein, das Sauerstoff liefert und die Integrität der Neuronen bewahrt.

Machen Sie einen gleichmäßigen horizontalen Schnitt, um den oberen Teil des Gehirnabschnitts zu entfernen.

Kippen Sie dann den Tisch und schneiden Sie den restlichen Abschnitt weiter ab, bis die Hörnervenwurzel sichtbar ist.

Richten Sie die Bühne neu aus. Drehen Sie es anschließend und stellen Sie die Klingenposition auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe ein.

Bewegen Sie die Klinge weg und richten Sie den Tisch wieder in seiner früheren Position aus. Schneiden Sie nun das Gehirn in eine Keilform, die auf der einen Seite dicker und auf der anderen dünner ist.

Die dickere Seite umfasst die Hörnervenwurzel, während die dünnere Seite miteinander verbundene Hörneuronen aufweist.

Beginnen Sie damit, mit einer Rasierklinge die Haut an der Mittellinie des Schädels von der Nase bis zum Nacken zu schneiden. Schäle die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und beginne an der Schädelbasis und fahre weiter zur Nase hin, indem du mit einer kleinen Schere einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie machst.

Machen Sie an der Lambda-Naht Schnitte in den Schädel von der Mittellinie seitlich zum Ohr auf beiden Seiten, um den Schädel zurückzuziehen und das Gehirn freizulegen. Beginnen Sie am rostralen Ende und heben Sie das Gehirn mit einem kleinen Laborspatel vorsichtig vom Schädel an, damit die Sehnerven durchtrennt werden können.

Fahren Sie fort, das Gehirn vorsichtig nach hinten zu bearbeiten, indem Sie die ventrale Oberfläche freilegen, und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Trigeminusnerven in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms vorsichtig einzuklemmen, um sie zu durchtrennen. Geben Sie das Präparat in eine mit kalter Schnittlösung gefüllte Petrischale aus Glas und stellen Sie die Schale unter ein Präpariermikroskop. Schneiden Sie die Gesichtsnerven in der Nähe des Hirnstamms ab, um die Nervus vestibulocochlearis freizulegen.

Schieben Sie die Spitzen mit einer feinen Pinzette so weit wie möglich in die Foramina, wo der Nervus vestibulocochlearis aus dem Schädel austritt. Kneifen Sie, um die Nerven auf beiden Seiten zu durchtrennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt bleibt.

Entfernen Sie die Hirnhäute und das Gefäßsystem von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers. Kneifen Sie dann die verbleibenden Hirnnerven und das Bindegewebe ein, um das Gehirn vollständig vom Schädel zu befreien, und achten Sie darauf, dass das verbleibende Rückenmark nach Möglichkeit erhalten bleibt.

Um die Oberfläche des Gehirns für die Befestigung auf der Bühne vorzubereiten, legen Sie das Gehirn mit der Bauchseite nach oben und verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren und das Hirngewebe zu stabilisieren. Führen Sie die offene Pinzette in einem Winkel von etwa 20 Grad durch das Gehirn bis zum Boden der Schale ein, so dass die Spitzen von der dorsalen Oberfläche des Gehirns kaudal zum Chiasma opticum austreten, und schneiden Sie mit einer Rasierklinge entlang der Pinzette.

Bereiten Sie dann einen 1 Kubikzentimeter großen Block aus 4% Agar vor und verteilen Sie einen kleinen Tropfen Kleber in einem Rechteck auf der Bühne. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Pinzette an und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit dem Rand eines Papiertuchs ab. Lege dann die blockierte Oberfläche so auf den Kleber, dass die Bauchfläche während des Schneidens in die Richtung der Klinge zeigt, und schiebe den Agarblock vorsichtig gegen die dorsale Oberfläche als Stütze.

Um Keilscheiben mit der Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und den medialen, olivocochleären Neuronen und dem medialen Kern des Trapezkörpers auf der dünnen Seite zu erhalten, platzieren Sie die Magnetscheibe mit dem daran befestigten Gehirn auf der Tischhalterung und platzieren Sie die Halterung in der Schnittkammer eines Vibratoms, wobei die ventrale Oberfläche des Gehirns zur Klinge hin ausgerichtet ist. Füllen Sie die Kammer mit eiskalter Schnittlösung und senken Sie die Klinge in die mit Karbogenblasen gefüllte Lösung.

Schneiden Sie die Scheiben kaudal in den interessierenden Bereich, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Verschieben Sie dann den Tisch um ca. 15 Grad zur Seite. Fahren Sie mit dem vorsichtigen Schneiden fort, bis die Hörnervenwurzel auf einer Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite der Scheibe zu sehen ist.

Verschieben Sie den Tisch um 15 Grad zurück in die ursprüngliche Position und bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg. Drehen Sie die Tischbasis um 90 Grad, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite zur Klinge zeigt, und senken Sie die Klinge um einige hundert Mikrometer, bevor Sie die Klinge langsam nahe an den Rand des Gewebes bringen. Senken Sie die Klinge bei leicht eingezogener Klinge auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe ab.

Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe zurück und drehen Sie die Tischbasis zurück, so dass die Bauchfläche zur Tischbasis zeigt. Machen Sie einen Schnitt, um die rostrale Oberfläche der Keilscheibe zu kennzeichnen, und übertragen Sie die Scheibe auf ein ein Quadratzentimeter großes Blatt Trennpapier. Schwanzfläche nach unten.

Der Nervus facialis sollte auf beiden Hemisphären des Schnitts auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein. Bringen Sie die Scheibe dann in eine 35 Grad Celsius heiße Inkubationskammer, um sich 30 Minuten lang zu erholen.