Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Beginnen Sie mit Zebrafischembryonen im frühen Entwicklungsstadium in Embryomedien.

Entfernen Sie das Chorion, die Schutzmembran, die die Embryonen umgibt, und übertragen Sie die Embryonen auf eine frische Kulturplatte mit Medien.

Entfernen Sie den Schwanzteil des Embryos, trennen Sie dann den Kopf und lösen Sie vorsichtig die Augen vom Kopf.

In den Augen befindet sich die Netzhaut, eine dünne Gewebeschicht, in der sich die Ganglienzellen der Netzhaut befinden.

Übertragen Sie die Augen in ein Röhrchen mit Zebrafisch-Zellkulturmedien.

Dissoziieren Sie die Augen mechanisch, um die retinalen Ganglienzellen freizusetzen und eine Einzelzellsuspension zu bilden.

Nehmen Sie Deckgläser, die in eine Kulturplatte mit Zebrafisch-Nährmedien gelegt werden.

Die Deckgläser sind mit einem synthetischen Polymer und einem Adhäsionsprotein beschichtet.

Übertragen Sie die Zellen auf die Mitte des Deckglases und inkubieren Sie.

Retinale Ganglienzellen heften sich an die beschichteten Oberflächen, und darüber hinaus entwickeln diese Zellen lange Vorsprünge, die Axone genannt werden.

Entnehmen Sie Zebrafischembryonen aus dem Inkubator und tauchen Sie die Embryonen für 5 bis 10 Sekunden in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale mit 70 % Ethanol, um sie zu sterilisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in die Schale E2 Media #1, die steriles E2-Medium enthält, um überschüssiges Ethanol abzuwaschen. Übertragen Sie dann die Embryonen in die E2 Media #2 Schale und entfernen Sie ihre Chorionen mit einer scharfen Pinzette. Übertragen Sie schließlich die Embryonen in die E2 Media #3-Schale, um die Sektionen durchzuführen.

Mit einer feinen Pinzette die Embryonen mit einer der Pinzetten vor dem Eigelb positionieren und halten und mit der anderen Pinzette den Schwanz hinter dem Dottersack entfernen. Fassen Sie den Hals mit einer Pinzette und nehmen Sie den Kopf ab, um das Gehirn und die Augen den E2-Medien auszusetzen. Rollen Sie mit der Spitze einer feinen Pinzette die Augen sanft vom Kopf weg, während Sie das Schädelgewebe mit der zweiten Pinzette festhalten. Übertragen Sie vier Augen auf eines der zuvor vorbereiteten Röhrchen, die ZFCM+ enthalten.

Zerreiben Sie mit der P20-Pipette etwa 45 Mal vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie das ZFCM+ mit den dissoziierten Zellen in die Mitte der Deckgläser. Halten Sie die Kulturen auf dem Labortisch bei 22 Grad Celsius auf einem Gestell aus Polystyrolschaum, um Vibrationen zu absorbieren. Überprüfen Sie die Zellen am Tag der Bildgebung unter dem Mikroskop, um das Wachstum der RGC-Axone zu validieren.