JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 1:56 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die extrazelluläre Polymere und Adhäsionsproteine enthält.
Besiedeln Sie die Vertiefungen mit einer einzelligen Suspension menschlicher embryonaler Stammzellen in einem Wachstumsmedium, das einen Rho-Kinase-Inhibitor enthält.
Inkubieren, um die Anheftung der Stammzellen an die Matrix zu ermöglichen.
Die Zellen absorbieren den Inhibitor, der die Rho-Kinase-Enzyme blockiert und den apoptotischen Zelltod verhindert.
Dies fördert das Überleben der Zellen und hält sie in einem undifferenzierten Zustand.
Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein neuronales Induktionsmedium, das reich an Wachstumsfaktoren ist und Inhibitoren enthält, die auf spezifische ALK-Rezeptoren abzielen.
Diese Inhibitoren interagieren mit deren Rezeptoren und blockieren die BMP- und TGF-β-Signalwege, wodurch die Zelldifferenzierung in endodermale oder mesodermale Vorläufer verhindert wird.
Dies führt zu einer selektiven Differenzierung von Stammzellen in ektodermale Vorläufer.
Diese ektodermalen Vorläufer nutzen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren aus dem Medium, um sich zu vermehren und später zu neuralen Vorläuferzellen zu differenzieren.
Die Zellen werden auf einer mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Well in 2 Millilitern mTeSR1 mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren plattiert. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Kulturmedium durch ein neuronales Induktionsmedium, das mit 1 mikromolaren Dorsomorphin und 5 mikromolaren SB431542 ergänzt wird. Wechseln Sie das Medium während der ersten vier Tage der neuronalen Induktion jeden zweiten Tag, dann jeden Tag, bis die Konfluenz am siebten Tag erreicht ist.