JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:50 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein menschliches Gehirngewebe, das in eine Schneidelösung getaucht ist. Der biologische pH-Wert und die Nährstoffe der Lösung tragen zur Aufrechterhaltung der Gewebefunktionalität bei.
Entfernen Sie die äußerste Hirnhäuteschicht und schneiden Sie das Gewebe ab, um eine ebene Oberfläche zu erhalten.
Tupfen Sie überschüssige Lösung aus dem Gewebe. Befestigen Sie das getrimmte Gewebe mit einem Agaroseblock an einer Probenscheibe und halten Sie das Gewebe in Kontakt mit dem Block, um das Schneiden zu erleichtern.
Legen Sie die Scheibe in eine Vibratom-Pufferschale und bedecken Sie das Gewebe mit einer eiskalten Schnittlösung.
Erzeugen Sie mit dem Vibratom gleichmäßige Scheiben, die die Gewebearchitektur erhalten.
Schneiden Sie überschüssiges Gewebe ab und sorgen Sie für einen gleichmäßigen Anteil an grauer und weißer Substanz.
Legen Sie die Scheiben in eine Multiwell-Platte, die ein Nährmedium enthält, und inkubieren Sie.
Die Scheiben bleiben im Medium suspendiert, um einen gleichmäßigen Nährstoffzugang zu gewährleisten, eine Technik, die als Free-Floating-Scheibenkultur bekannt ist.
Füllen Sie die Kultur regelmäßig mit einem mit neuronalen Wachstumsfaktoren supplementierten Medium auf, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
Übertragen Sie die Probe in eine Petrischale mit Schnittlösung. Entfernen Sie mit feinen chirurgischen Instrumenten vorsichtig so viel wie möglich von den verbleibenden Hirnhäuten. Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des Versuchsdesigns und verwenden Sie eine Skalpellklinge mit der Nummer 24, um eine ebene Oberfläche als Basis zu schneiden, die auf die Probenscheibe geklebt wird.
Sammeln Sie mit einem Einweg-Plastiklöffel und feinen Pinseln das Fragment aus der Petrischale und trocknen Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier ab. Als nächstes befestigen Sie das Gewebe mit Sekundenkleber an der Vibratom-Probenschale, bis es fest mit der Schale haftet und mit dem Agaroseblock in Kontakt kommt.
Legen Sie die Vibratom-Probenscheibe in die Vibratom-Pufferschale ein. Verriegeln Sie den Messerhalter mit fester Rasierklinge. Fügen Sie die Schneidlösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sie sowohl die Probe als auch die Klinge bedeckt. Beginnen Sie dann, die Probe in 200-Mikrometer-Scheiben zu schneiden.
Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale in eine Petrischale mit Schnittlösung und schneiden Sie lose Ränder und überschüssige weiße Substanz auf einen Anteil von ca. 70 % Kortex und 30 % weißer Substanz ab. Geben Sie in einem Laminar-Flow-Schrank 600 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie mindestens 20 Minuten lang bei 36 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Scheiben plattieren. Verwende danach einen Pinsel, um eine Scheibe in jede Vertiefung zu füllen.
Wenn sich unbenutzte Vertiefungen in der Platte befinden, füllen Sie diese mit 400 Mikrolitern sterilem Wasser. Inkubieren Sie bei 36 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. 10 Milliliter des zuvor vorbereiteten Nährmediums mit dem aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter ergänzen.
Entfernen Sie nach 8 bis 16 Stunden 333 Mikroliter des konditionierten Mediums aus jeder Vertiefung und fügen Sie 133 Mikroliter frisches, mit BDNF ergänztes Medium hinzu. Ersetzen Sie alle 24 Stunden ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches, mit BDNF ergänztes Medium.