Eine Technik zur verlängerten Inkubation von neuronalem Gewebe der Netzhaut

0 Ansichten3:30 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie ein intaktes Mausauge in künstlichem Liquor (aCSF) und schneiden Sie ein, um die Augenmuschel mit der Netzhaut zu isolieren.

Behandeln Sie mit einer enzymatischen Lösung, um die innere Grenzmembran zu entfernen und die neuronalen Zellen freizulegen.

Tauchen Sie das Gewebe in eine Hemmlösung, um die Verdauung zu stoppen, und waschen Sie es, um überschüssige Lösung zu entfernen.

Legen Sie das Gewebe bei niedriger Temperatur in einen speziellen Inkubator, um den Zellstoffwechsel zu verlangsamen und das Gewebe zu erhalten.

Dieser Inkubator besteht aus einer Hauptkammer mit einem Netz zur Aufnahme von Geweben. Die Kammer ist mit aCSF gefüllt und seine Temperatur und sein pH-Wert werden kontrolliert, um die Funktionalität des Gewebes zu erhalten.

Um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden, wird der aCSF in eine andere Kammer gepumpt und mit ultravioletter Strahlung behandelt, um alle Mikroben abzutöten.

Das sterilisierte aCSF wird dann wieder in die Hauptkammer gepumpt.

Um die Netzhaut zu isolieren, entfernen Sie die Augenmuschel, trennen Sie die Netzhaut vom umgebenden Gewebe und legen Sie sie wieder in den Inkubator.

Für die Präparation einer Netzhaut-Ganzlafette entkernen Sie sofort die Augen eines euthanasierten Tieres. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und legen Sie die Augen entweder in Ames Media oder aCSF mit Carbogen bei Raumtemperatur. Entfernen Sie danach sofort die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper, indem Sie mit einer kleinen Schere entlang der Ora serrata schneiden und mit einer Pinzette entfernen. Legen Sie das Gewebe bei Raumtemperatur in das Inkubationssystem.

Um die innere Begrenzungsmembran zu entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel mit der Netzhaut für 20 Minuten in ein kleines Glasgefäß mit Papain, L-Cystein, EDTA und DNAse bei 37 Grad Celsius. Tragen Sie Carbogen durch den Deckel auf die Lösung auf, aber sprudeln Sie nicht. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang in eine Ovomucoid- und BSA-Lösung in Earl's BSS legen. Waschen Sie dann das Tuch gründlich mit aCSF.

Anschließend überführen Sie das Gewebe in das Inkubationssystem und reduzieren die Temperatur auf etwa 15 bis 16 Grad Celsius. Übertragen Sie anschließend das Netzhautgewebe auf das Mikroskop; Isoliere die Netzhaut von der Augenmuschel und schneide sie mit einer Rasierklinge in vier Stücke. Wenn die gesamte Netzhaut benötigt wird, machen Sie vier kleine Schnitte in der Peripherie der Netzhaut, damit sie flach liegen kann.

Dieses Gewebe kann nun für die Elektrophysiologie auf das Mikroskop übertragen oder im Braincubator aufbewahrt werden. Das Gewebe wird in der Hauptkammer aufbewahrt, in der sich die Sonden für pH- und Temperaturmessungen befinden. Eine zweite Kammer ist von der Hauptkammer isoliert und wird mit 1,1 Watt UVC-Licht bestrahlt, um in der Lösung schwimmende Bakterien zu bestrahlen. Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um aCSF durch die beiden Kammern zirkulieren zu lassen, und eine thermoelektrische Peltier-Kühlplatte, um die Hauptkammer entweder zu kühlen oder zu heizen.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026