Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subkallosalen Zone der Maus

Beginnen Sie mit einem Mäusegehirn auf einer gekühlten Gehirnmatrix.

Ermitteln Sie Schnitte, die die subkallosale Zone oder SCZ enthalten. Übertragen Sie den Schnitt in einen kalten Phosphatpuffer.

Schneiden Sie unter einem Präpariermikroskop den SCZ-Teil aus.

Den sezierten SCZ in kleinere Stücke schneiden.

Übertragen Sie diese Stücke in einen Verdauungspuffer. Inkubieren, um die Zellen vom Gewebe zu trennen.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Medium.

Übertragen Sie die Zellen auf eine Kulturplatte und fügen Sie spezifische Wachstumsfaktoren hinzu.

Die adulten neuralen Stammzellen teilen sich und bilden Cluster, die Neurosphären genannt werden.

Eine unsachgemäße Nährstoffverteilung in Zellclustern schränkt das Zellwachstum ein.

Um die Cluster zu dispergieren, wird der Überstand zentrifugiert und verworfen. Halten Sie die Cluster in einem Dissoziationspuffer erneut an, und inkubieren Sie sie.

Pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um einzelne Zellen zu erzeugen.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Zellen und überführen Sie sie in ein geeignetes Medium, um eine Monoschicht zu erhalten.

Übertragen Sie nach dem Präparieren das Gehirn der Maus in einen kalten PBS-Puffer und spülen Sie ihn zweimal aus, um überschüssiges Blut zu entfernen. Legen Sie als Nächstes das Gehirn in die Gehirnmatrix auf Eis und machen Sie koronale Schnitte, um ein Millimeter dicke Scheiben zu erhalten. Übertragen Sie anschließend die hinteren Hirnschnitte, die SCZ-Regionen enthalten, auf kaltes PBS.

Unter einem Präpariermikroskop mit geringer Vergrößerung wird das SCZ mit einer gebogenen 30-Gauge-Nadel aus dem Bereich der weißen Substanz des Kortex und des Hippocampus mikrodisseziert. Entfernen Sie dann die Kortexregionen über der SCZ und platzieren Sie die sezierte SCZ in kalter PBS in einer 35-Millimeter-Petrischale auf Eis.

Der Bereich der subkallosalen Zone kann mit Hilfe einer Gehirnmatrix und einer gebogenen 30-Gauge-Nadel präzise aus dem gesamten Gewebe präpariert werden.

Entfernen Sie danach das PBS und hacken Sie das präparierte Gewebe sofort in kleine Stücke. Suspendieren Sie sie mit einem Milliliter Verdauungspuffer. Anschließend wird die Probe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern Aufschlusspuffer umgefüllt. Inkubieren Sie es dann 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Klopfen Sie in diesem Schritt leicht auf das Röhrchen, um das verdaute Gewebe zu dissoziieren, und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann fünf Minuten lang bei 145 mal g. Nach fünf Minuten wird der Überstand verworfen, das verdaute Gewebe mit einem Milliliter vorgewärmtem und zwei Millilitern Medium resuspendiert, um den Aufschlusspuffer auszuwaschen, und die Probenlösung maximal fünfmal vorsichtig pipettiert.

Anschließend zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 145-mal g für fünf Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in einem Milliliter N2-Medium resuspendiert. Geben Sie einen Milliliter N2-Medium in eine unbeschichtete Sechs-Well-Platte und fügen Sie einen Milliliter der suspendierten Zellen hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten.

Geben Sie anschließend 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Sechs-Well-Kulturschale vorsichtig von Hand, um die zugesetzten Wachstumsfaktoren mit den plattierten Zellen zu vermischen. Bewahren Sie die Sechs-Well-Platte dann in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf.

Geben Sie acht Tage lang täglich 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF in jede Vertiefung. Fügen Sie jeden dritten Tag 200 Mikroliter N2-Medium hinzu, um etwa zwei Milliliter des Mediums zu erhalten. Hier ist ein Bild der Neurosphären nach acht Tagen.

Sammeln Sie bei diesem Verfahren die Neurosphären und übertragen Sie sie in eine neue 15 Millimeter große konische Röhre. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 145 mal g. Verwerfen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Neurosphären mit 0,5 Millilitern Dissoziationspuffer. Inkubieren Sie sie fünf Minuten lang mit 0,5 Millilitern Dissoziationspuffer in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad, um die Neurosphären in einzelne Zellen zu dissoziieren.

Pipettieren Sie die Probenlösung weniger als fünfmal vorsichtig auf und ab und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 145-mal g. Verwerfen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Neurosphären mit einem Milliliter N2-Medium. Nachdem Sie eine Sechs-Well-Platte mit PLL-Laminin beschichtet haben, plattieren Sie die Zellen bei 2,5 x 10⁵ Zellen pro Milliliter mit zwei Millilitern N2-Medium pro Well. Pflegen Sie die adulten neuralen Stammzellen der SCZ mit einer täglichen Behandlung mit Wachstumsfaktoren für fünf Tage, bevor Sie sie passieren.