Erzeugung reifer Kleinhirn-Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit Hilfe von Einweg-Bioreaktoren

Säen Sie humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) in einem Bioreaktor aus. Die iPSCs werden in Medien resuspendiert, die einen zellulären Apoptose-Inhibitor enthalten.

Unter einem Magnetfeld dreht sich das vertikale Rad des Bioreaktors mit einer kontrollierten Geschwindigkeit, was den Zell-Zell-Kontakt und die Aggregatbildung erleichtert. Entfernen Sie die meisten Medien und fügen Sie frische Medien ohne Inhibitor hinzu.

Kultivieren Sie weiter. Sobald die Aggregate eine optimale Größe erreicht haben, lassen Sie sie durch die Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie das Medium.

Fügen Sie Differenzierungsmedien hinzu, die Wachstumsfaktoren enthalten, und kultivieren Sie mit einer reduzierten Drehzahl des Bioreaktorrads. Die Wachstumsfaktoren fördern die neuronale Differenzierung innerhalb der Aggregate.

Fügen Sie anschließend frisches Medium hinzu, das mit Wachstumsfaktoren und Chemokinen ergänzt wird, die die Entwicklung von Kleinhirnvorläuferzellen induzieren.

Nach und nach organisieren sich die Kleinhirnvorläuferzellen in unterschiedlichen Schichten innerhalb der Aggregate und bilden frühe Kleinhirnorganoide.

Fügen Sie schließlich ein neuronales Medium hinzu, das spezifische neurotrophe Faktoren enthält.

Diese Faktoren induzieren die Reifung der Kleinhirnvorläuferzellen zu synaptisch aktiven funktionellen Kleinhirnneuronen, wodurch reife Organoide entstehen.

An Tag 1, wobei Tag 0 der Tag der Aussaat des Bioreaktors ist, platzieren Sie den Bioreaktor und die Basiseinheit in einer sterilen Strömungshaube. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um eine 1-Milliliter-Probe der Zellsuspension zu entnehmen. Plattieren Sie die Zellsuspension in einer 24-Well-Platte mit extrem geringer Befestigung. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich iPSC-abgeleitete Aggregate gebildet haben. Wenn ja, nehmen Sie Bilder der Aggregate mit 40x oder 100x auf.

Kultivieren Sie die iPSCs im Bioreaktor weiter, bis der durchschnittliche Durchmesser der Aggregate 100 Mikrometer beträgt. Ersetzen Sie dann 80 % des Mediums durch frisches mTesR1 ohne ROCK-Inhibitor. Wenn die Aggregate einen Durchmesser von 200 bis 250 Mikrometern erreichen, lassen Sie alle Organoide am Boden des Bioreaktors absetzen. Ersetzen Sie dann das gesamte verbrauchte Medium durch gfCDM-Differenzierungsmedium.

Stellen Sie das Basisgerät und den Bioreaktor in den Inkubator und verringern Sie das Rühren auf 25 U/min.