Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Nehmen wir ein durchblutetes Mäusegehirn, das einen Tumor enthält.

Durch den Perfusionsschritt werden zirkulierende Immunzellen entfernt, die tumorinfiltrierten Zellen bleiben jedoch erhalten.

Isolieren Sie das Gewebe, das den Tumor enthält.

Dissoziieren Sie nun das Gewebe mechanisch.

Durch die mechanische Kraft wird das Gewebe gelockert und die Zellen werden freigesetzt.

Übertragen Sie das dissoziierte Gewebe in ein Röhrchen.

Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Überstand, der Rückstände enthält.

Resuspendieren Sie das Gewebe in einer Verdauungslösung, die Kollagenase und DNase enthält.

Kollagenase baut die extrazelluläre Matrix ab und setzt die Zellen frei. DNase baut kontaminierende DNA ab.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.

Filtern Sie die Suspension, um Zellaggregate zu entfernen und eine einzellige Suspension zu erhalten.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie Zellen in einem Gradientenmedium mit hoher Dichte. Überlagern Sie nun mit einem Gradientenmedium mit geringerer Dichte, wodurch ein Separationsgradient mit einer klaren Schnittstelle entsteht.

Zentrifugieren Sie, um die Schichten zu trennen. Immunzellen sammeln sich an der Grenzfläche zwischen Gradientenmedien, während Zelltrümmer darauf schwimmen.

Sammeln Sie die Immunzellen für die weitere Analyse.

Bei diesem Verfahren isolieren Sie mit einer sauberen, einschneidigen Rasierklinge den Bereich des Gehirns, der den Tumor enthält, indem Sie einen sagittalen Schnitt in der Mitte des Gehirns machen, um die beiden Hemisphären zu halbieren. Drehen Sie die ipsilaterale Hemisphäre mit der medialen Seite nach unten und machen Sie einen koronalen Schnitt am Kleinhirn und einen weiteren Schnitt am Riechkolben, um das Zielgewebe zu isolieren, das das Tumorimplantat enthält.

Legen Sie als Nächstes das Zielgewebe in die beschriftete Glass-Down-Gewebeschleifmaschine, die 1 Milliliter DPBS enthält. Schieben Sie den Kolben ganz nach unten und drehen Sie ihn siebenmal, um das Gewebe zu zerbrechen. Heben Sie danach den Kolben an, damit sich die Flüssigkeit wieder auf dem Boden des Tissue-Grinders absetzen kann. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Drehen Sie den Kolben jedoch nur viermal während der nächsten zwei Wiederholungen und dreimal während der letzten Wiederholung, um eine Überreibung des Gehirngewebes zu vermeiden.

Tragen Sie anschließend drei 1-Milliliter-Volumina eiskaltes DPBS auf die Seiten des Kolbens auf, um die verbleibende Hirnsubstanz in den Gewebeschleifer zu spülen. Dann resuspendieren Sie die verreibte Gehirnsubstanz, indem Sie auf und ab pipettieren und in ein beschriftetes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis geben. Spülen Sie die Seiten des DAPS-Tissue-Grinders mit zusätzlich 1 Milliliter eiskaltem DPBS ab und geben Sie es in dasselbe 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Bewahren Sie alle Röhrchen mit verreibter Gehirnsubstanz auf Eis auf, bis alle Proben verarbeitet sind. Dann schleudern Sie die verreibte Hirnsubstanz in den 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen 20 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 740 mal g ab. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierte Gehirnsubstanz in 1 Milliliter einer zuvor hergestellten Mischung aus Kollagenase und DNase I-Verdauungsenzymen.

Legen Sie die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglasgestell und stellen Sie das Gestell 15 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, dann rühren Sie die Proben während der Inkubationszeit zweimal vorsichtig um, indem Sie die Röhrchen schnippen, um die Gewebedisaggregation zu erleichtern.

Geben

Sie anschließend 6 Milliliter eiskaltes DPBS in jedes Röhrchen, um die Verdauungsenzyme zu verdünnen. Pipettieren Sie zum Resuspendieren auf und ab und filtern Sie das Gesamtvolumen durch sterile 70-Mikron-Nylonnetzfilter in neue, beschriftete 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.

Schleudern Sie anschließend die Suspension der Gehirnzellen 20 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit dem 740-fachen g herunter, um ein einzelliges Pellet zu erhalten. Nehmen Sie die 15-Milliliter-Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf Eis. Erhöhen Sie dann die Temperatureinstellung an der Zentrifuge auf etwa 21 Grad Celsius, um den nächsten Schritt vorzubereiten.

Entfernen Sie anschließend den Zellüberstand vollständig und resuspendieren Sie die Zellpellets zunächst in 1 Milliliter Zentrifugationsmedium mit 70 % Dichte unter Verwendung einer P1000-Mikropipette. Geben Sie dann vier weitere Milliliter Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 70 % in jedes Röhrchen. Setzen Sie die Kappen fest auf und homogenisieren Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen.

Übertragen Sie danach die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Gehirnzellen, die in Zentrifugationsmedien mit einer Dichte von 70 % aus dem Eis resuspendiert sind, wieder bei Raumtemperatur in ein Reagenzglas. Lagern Sie nacheinander vorsichtig 2 Milliliter Zentrifugationsmedienlösung mit 37 % Dichte auf die 5 Milliliter mit Zentrifugationsmedien mit 70 % Dichte, um eine saubere Grenzfläche zwischen den beiden Zentrifugationsmedienschichten zu bilden.

Markieren Sie dann die Position der Grenzfläche zwischen den beiden Schichten mit einem Marker mit feiner Spitze, damit sie nach dem Zentrifugieren leicht identifiziert werden kann, wenn die Unterscheidung weniger offensichtlich wird. Drehen Sie die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 740 g ohne Pause herunter, um eine Unterbrechung der Grenzfläche zwischen den Dichtezentrifugationsmedienschichten zu vermeiden.

Sammeln Sie anschließend die PBMCs, die sich an der Grenzfläche zwischen den beiden Dichtezentrifugationsmedienschichten angesammelt haben, indem Sie eine P200-Mikropipette in das Röhrchen einführen und die Lipidschicht vorsichtig umgehen. Sobald Sie sich auf der Höhe der PBMC-Bande befinden, extrahieren Sie langsam 200 Mikroliter von der Oberfläche der Zentrifugationsmedienschicht mit einer Dichte von 70 % und überführen Sie sie in ein entsprechend markiertes Polypropylen-FACS-Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um ein Gesamtvolumen von 400 Mikrolitern pro Probe zu erreichen.