Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Nehmen Sie das Rückenmark eines Rattenembryos mit angehängten Spinalwurzelganglien (DRGs), die Neuronen und Gliazellen enthalten.

Lösen Sie einzelne DRGs vom Strang, übertragen Sie sie in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie, wobei Sie alle Gewebereste entsorgen.

Fügen Sie Enzyme hinzu, um DRG-Neuronen und Gliazellen zu dissoziieren.

Schleudern Sie die Zellen herunter und entfernen Sie alle Ablagerungen. Fügen Sie ein neuronales Erhaltungsmedium hinzu und trituieren Sie, um eine einzellige Suspension zu erzeugen.

Übertragen Sie die Suspension in eine Mikrotiterplatte, die mit einem Kultursubstrat beschichtet ist, um die Zelladhärenz zu fördern.

Geben Sie ein Reinigungsmedium ein und inkubieren Sie. Die hemmenden Wirkstoffe des Mediums eliminieren sich teilende Gliazellen, während sich nicht teilende Neuronen überleben.

Nehmen Sie Schwann-Zell-ähnliche Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium ein. SCLCs, die Vorläufer der Schwann-Zellen, interagieren mit embryonalen peripheren Nervenneuronen.

Führen Sie die Suspension in die DRG-Neuronen ein und inkubieren Sie. Die Interaktion der SCLCs mit DRG-Neuronen fördert deren Reifung zu Schwann-Zellen.

Die erzeugten Schwann-Zellen stehen für die Analyse bereit.

Um die Spinalganglien zu entnehmen, wird der erste Embryo in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit raumwarmem PBS unter einem Präpariermikroskop in Bauchlage übertragen und eine Mikro-Präparierzange auf beiden Seiten des Rückenmarks eingeführt.

Trennen Sie das Rückenmark durch stumpfe Dissektion vom umgebenden Weichgewebe und entfernen Sie das Rückenmark mit einer Zange entlang der Halsöffnung und des Schwanzstumpfes. Entfernen Sie das restliche Weichgewebe aus dem befreiten Rückenmark, bis nur noch das Rückenmark, die Nervenwurzeln und das daran befestigte Spinalganglion übrig sind.

Lösen Sie die einzelnen Spinalganglien von ihren verbindenden Nervenwurzeln. Verwenden Sie dann einen Pipettenstift, der mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, um bis zu 100 dorsale Wurzelganglien in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS zu übertragen.

Sammeln Sie die Ganglien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz pro Röhrchen. Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius zentrifugieren Sie die Spinalganglien erneut mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Pellets im postganglionären Neuronenerhaltungsmedium der Dorsalwurzel vorsichtig zu zerreiben.

Die Spinalganglienzellen werden mit 5 x 10³ Zellen pro Quadratzentimeter auf Poly-D-Lysin-Laminin-beschichtete Sechs-Well-Platten in 1,5 Millilitern Neuronenerhaltungsmedium für Spinalganglien pro Vertiefung ausgesät.

Nach zwei Tagen in Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ waschen Sie die Zellen und geben Sie die neuronalen Zellkulturen für weitere zwei Tage in den Inkubator in frischem Aufreinigungsmedium für Spinalganglien-Neuronen zurück.

Nach 3 bis 4 Erhaltungs- und Reinigungszyklen sollten die Zellkulturen der Spinalganglien positiv auf den neuronalen Marker Tuj-1 und negativ auf den Gliazellmarker S100 beta getestet werden.

Am 7. Tag der schwank-zellähnlichen Zellkultur spülen Sie die Zellen in PBS, gefolgt von einer Dissoziation mit 0,5 Millilitern rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für 5 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Co-Kulturmedium und säen Sie die Schwann-Zell-ähnlichen Zellen bei 1 x 10 bis 3 Zellen pro Quadratzentimeter für 1 x 10 bis³ Zellen pro Quadratzentimeter für 14 Tage Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ auf die gereinigte Spinalganglien-Neuronenkultur.