Replattierung differenzierter Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Beginnen Sie mit einer großen Kulturplatte, die aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene differenzierte Neuronen mit einem dichten neuronalen Netzwerk enthält.

Inkubieren Sie diese Neuronen mit milden proteolytischen Enzymen, um sie von der Platte zu lösen und sie als Blatt anzuheben.

Bei fortgesetzter Inkubation stören Enzyme die Zellverbindungen teilweise und lockern die neuronalen Netzwerke.

Fügen Sie ein Nährmedium hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen.

Pipettieren Sie die abgelösten Neuronen wiederholt, um sie voneinander zu trennen.

Filtern Sie die Neuronen durch ein Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen und die einzelnen Neuronen zu sammeln.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie sie in einem Wachstumsmedium.

Für die Neubeschichtung säen Sie diese Neuronen auf ein Polymer und eine mit Adhäsionsproteinen beschichtete Multi-Well-Platte. Inkubieren, um ihre Anheftung zu ermöglichen.

Neuronen nutzen Nährstoffe aus dem Medium, um lebensfähig zu bleiben. Tauschen Sie das Nährmedium regelmäßig aus, um den Nährstoffgehalt aufrechtzuerhalten.

Inkubieren Sie weiter, um die neuronale Reifung und die Bildung von Verbindungen zwischen ihnen zu ermöglichen.

Beginnen Sie damit, die Platte der differenzierten Neuronen vorsichtig mit PBS zu spülen. Dispergieren Sie das PBS an der Wand der Platte und nicht direkt auf den Zellen, um eine Störung der Zellen zu vermeiden. Aspirieren Sie das PBS vom Rand der Schale, während Sie es kippen, und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu berühren.

Tragen Sie mindestens 1 Milliliter proteolytisches Enzym pro 10-Zentimeter-Platte auf und stellen Sie die Zellen für 40 bis 45 Minuten in den Inkubator zurück. Überprüfen Sie während der Inkubation die Neuronen an einem Phasenkontrastmikroskop und setzen Sie die Proteasebehandlung fort, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und auseinanderzubrechen beginnt. Wenn sich die Neuronen abgelöst haben, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 5 Milliliter frisches DMEM-Medium pro 1 Milliliter Protease hinzufügen.

Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen 5 bis 8 Mal vorsichtig gegen die Platte zu reiben, und achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben. Siehen die Zellen tropfenweise durch ein 100-Mikrometer-Netz in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen ab und spülen Sie das Sieb mit weiteren 5 Millilitern frischem DMEM-Medium aus.

Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Zellen 5 Minuten lang bei 1.000 g zu schleudern. Nach der Zentrifugation wird das konische Röhrchen wieder in die Biosicherheitswerkbank gestellt und der größte Teil des Mediums abgesaugt, wobei 250 Mikroliter übrig bleiben, um die Zellen feucht zu halten. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 2 Millilitern frischem DMEM-Medium und führen Sie sie durch das Ende einer serologischen 5-Milliliter-Pipette.

Zum Schluss drehen Sie das Rohr 2 bis drei Mal um. Verwenden Sie ein Hämozytometer und Trypanblau, um die lebensfähigen Zellen zu zählen, und verdünnen Sie die Zellen dann mit frischem DMEM auf die gewünschte Konzentration. Fügen Sie dem Röhrchen je nach den Anforderungen der jeweiligen Zelllinie geeignete Zusätze hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie das konische Röhrchen 2 bis 3 Mal kippen.

Aspirieren Sie die Lamininbeschichtung von einer 24-Well-Platte und spülen Sie sie einmal mit PBS aus. Aspirieren Sie das PBS und tragen Sie die Zelllösung in einer Achterbewegung auf jede Vertiefung auf, um ein Verklumpen zu vermeiden. Wenn Sie mit der Beschichtung der Zellen fertig sind, stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist.