Isolierung induzierter neuraler Vorläuferzellkolonien, die aus adulten humanen Fibroblasten stammen

Beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von induzierten neuralen Vorläuferzellkolonien, die von adulten menschlichen Fibroblasten in einer lamininbeschichteten Multi-Well-Platte stammen.

Waschen Sie die Kolonien mit einem Puffer, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen, und fügen Sie dann frischen Puffer hinzu.

Kratzen Sie um einzelne Kolonien herum, um umliegende Zellen zu entfernen.

Die Kolonien werden in frische, mit Laminin beschichtete Vertiefungen mit Neuroinduktionsmedium überführt.

Die Kolonien werden mechanisch zerlegt, um eine einzellige Suspension zu erhalten.

Laminin, ein extrazelluläres Matrixprotein, interagiert mit den Oberflächenproteinen der Vorläuferzellen und erleichtert so die Zelladhäsion an der Well-Oberfläche.

Fügen Sie einen niedermolekularen Inhibitor hinzu, der in die Zellen eindringt und spezifische Proteinkinasen blockiert, wodurch die zelluläre Apoptose verhindert wird.

Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, die im Neuroinduktionsmedium vorhanden sind, erleichtern die Proliferation der Vorläuferzellen.

Ersetzen Sie das Medium regelmäßig, um die Nährstoffe wieder aufzufüllen und die fortgesetzte Proliferation der Vorläufer zu erleichtern.

Eine konfluente Kultur oder eine vollständig bedeckte Zellschicht zeigt die erfolgreiche Expansion von induzierten neuralen Vorläuferzellen an.

Einen Tag später aspirieren Sie Laminin aus den Platten und fügen Sie 200 Mikroliter neuronales Induktionsmedium in die Vertiefungen hinzu. Waschen Sie die Sechs-Well-Platten mit den zu pflückenden Kolonien einmal mit DPBS, bevor Sie 2 Milliliter neuronales Induktionsmedium pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzufügen.

Entnehmen Sie die Zellen mechanisch, indem Sie mit einer dünnen Nadel um die Kolonien herumkratzen, um die umgebenden Zellen loszuwerden, und entnehmen Sie die Kolonien mit Pipettenspitzen, die auf einer 200-Mikroliter-Pipette montiert sind, die auf 50 Mikroliter eingestellt ist.

Übertragen Sie jede Kolonie in eine Vertiefung einer lamininbeschichteten 48-Well-Platte und erzeugen Sie mechanisch eine Einzelzellsuspension, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie den Zellen einen Rho-Kinase-Inhibitor in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu. Züchten Sie die Zellen auf der 48-Well-Platte bei 37 Grad Celsius, 5 % CO₂ für zwei Tage. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen.