Eine modifizierte Rollenrohrmethode für die Langzeitkultur von Hirnschnitten von Nagetieren

Nehmen Sie Gehirnschnitte, die aus einem Nagetiergehirn gewonnen wurden. Die Schnitte bestehen aus dem Hippocampus, in dem sich Hippocampus-Neuronen befinden.

Übertragen Sie die Gehirnschnitte auf Deckgläser, die Hühnerplasma enthalten.

Tragen Sie mit Thrombin gemischtes Plasma auf die Scheiben auf. Thrombin induziert die Plasmakoagulation und bildet ein biologisches Gerüst, das die Haftung der Scheiben an den Deckgläsern fördert.

Nehmen Sie flache Rollenrohre mit einem Loch auf der flachen Seite und einer Klebescheibe, die um das Loch an der Außenseite der Rohre befestigt ist.

Positionieren Sie die Deckgläser auf den Klebeplättchen und achten Sie darauf, dass die Hirnschnitte zum Inneren der Röhrchen zeigen.

Geben Sie ein neuronales Kulturmedium in die Röhrchen und lassen Sie ein Kohlendioxid-Luft-Gemisch einströmen.

Verschließen Sie die Röhrchen, legen Sie sie in ein Rollengestell und inkubieren Sie sie mit einer Rollbewegung.

Die Belüftung durch die rollende Inkubation und die Nährstoffe des Mediums unterstützen die langfristige Kultivierung der Hirnschnitte.

Bereiten Sie zunächst das Rollenrohrgestell vor und machen Sie eine Vorrichtung, um das Bohren eines Lochs in die Rollenrohre zu unterstützen, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Halten Sie mit der Vorrichtung ein flaches, 1 Zentimeter langes Kulturröhrchen aus Kunststoff so in Position, dass die flache Seite nach oben zeigt. Bohren Sie dann ein Loch mit einem Durchmesser von 6 Millimetern, dessen Mitte 1 Zentimeter von unten entfernt und zwischen den Seiten des Rohrs zentriert ist.

Glätten Sie mit dem schwenkbaren Entgratwerkzeug die Kanten des Lochs und machen Sie vier Rillen an der Innenkante des Lochs, um das Entleeren des Lochs während der Drehung zu erleichtern. Spülen Sie die Tuben anschließend mit 70 % Ethanol und trocknen Sie sie anschließend in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft. Sterilisieren Sie die Schläuche in einigen 12 Millimeter gestanzten Silikonkautschuk-Klebescheiben für 40 Minuten unter der UV-Lampe.

Positionieren Sie die Schläuche und Scheiben nach 20 Minuten neu, sodass alle freiliegenden Oberflächen sterilisiert sind. Ziehen Sie anschließend die weiße Unterlage von der Klebescheibe ab. Richten Sie die Löcher aus und befestigen Sie den Silikonkautschuk an der Außenseite des Schlauchs.

Sobald die Scheiben erhalten wurden, geben Sie 2 Mikroliter Hühnerplasma auf die Mitte der fotogeätzten Seite eines vorbereiteten Deckglases. Verteilen Sie das Plasma leicht, um einen Fleck mit einem Durchmesser von 3 bis 4 Millimetern zu erhalten. Verwenden Sie dann einen sterilen Spatel mit schmaler Spitze, um ein vorbereitetes Hirnschnitt anzuheben. Verwenden Sie eine geschlossene Pinzette, um die Scheibe auf der Spachtelspitze zu halten, während Sie die Scheibe anheben. Berühren Sie den Spachtel mit dem Plasmafleck auf dem Deckglas und schieben Sie die Scheibe mit geschlossener Pinzette auf das Deckglas.

Tragen Sie eine dünne Schicht Kükenplasma auf das Deckglas auf, bevor Sie die Scheibe platzieren, und eine minimale Menge Thrombin-behandeltes Plasma, um die Scheibe zu bedecken. Wenn die Scheibe schwimmt, bleibt sie nicht haften, wenn das Gerinnsel entfernt wird.

Mischen Sie anschließend 2,5 Mikroliter Plasma und 2,5 Mikroliter Thrombin in einem separaten Röhrchen. Geben Sie schnell 2,5 Mikroliter dieser Mischung über und um die Scheibe und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen. Entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung von der freiliegenden Seite des zuvor auf dem Rollenrohr angebrachten Silikonkautschukklebers. Legen Sie dann das Deckglas mit der Gehirnscheibe auf den Klebstoff und richten Sie die Scheibe innerhalb des Lochs aus.

Um die Haftung zu gewährleisten, üben Sie mit dem Daumen einen sanften, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas aus, indem Sie das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und ca. 1 Minute lang halten, während Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank übertragen.

Der Druck auf das Deckglas, um es ohne Undichtigkeit an der Tube zu befestigen, muss genau richtig sein und lange genug aufrechterhalten werden, um Luftkanäle im Dichtmittel zu beseitigen. Zu viel Druck führt zu Rissen im Deckglas.

Geben Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank 0,8 Milliliter vollständiges neurobasales A-Kulturmedium in jedes Röhrchen. Lassen Sie dann ein Gemisch aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft durch eine sterile, mit Watte verstopfte Weidepipette fließen, die sicher von einer Klemme gehalten wird. Verwenden Sie dies, um das Rollenrohr mit dem Gasgemisch zu spülen und das Röhrchen schnell zu verschließen, wenn es um die Pipette herum herausgezogen wird.

Beschriften Sie als Nächstes die Röhrchen mit der Scheibennummer und der Racknummer. Legen Sie die Rohre in ein Rollengestell und achten Sie darauf, dass sie geometrisch ausbalanciert sind. Wenn es eine ungerade Anzahl von Röhren gibt, fügen Sie leere Röhren hinzu, um sie auszugleichen.

Stellen Sie die Gestelle in einen 35 Grad Celsius heißen Walzeninkubator, wobei die Rollen das Rollengestell drehen, um das Medium im Boden der Röhrchen zu halten. Kippen Sie den Inkubator um ca. 5 Grad nach hinten, indem Sie die Vorderseite auf ein Brett heben.