Generierung von Neuronen durch Reprogrammierung menschlicher dermaler Fibroblastenzellen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:32 Min. • July 8th, 2025
Führen Sie adulte humane dermale Fibroblasten oder aHDFs, die in einem Fibroblastenmedium suspendiert sind, in eine mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtete Mikroplatte ein. Inkubieren, um die Zelladhärenz zu ermöglichen.
Einführung eines transgenen lentiviralen Vektors. Bei der Internalisierung in die Wirtszelle wird die virale RNA in DNA reverse-transkribiert, die sich in das Wirtsgenom integriert.
Die virale DNA exprimiert Transkriptionsfaktoren und kurze Haarnadel-RNAs oder shRNAs. Zelluläre Nukleasen verarbeiten die shRNAs zu kleinen interferierenden RNAs oder siRNAs.
Die erzeugten siRNAs bauen die mRNA ab, die für transkriptionelle Repressoren kodiert, wodurch deren Expression gehemmt und die Aktivierung von neuronalen Differenzierungsgenen ermöglicht wird.
Die Transkriptionsfaktoren aktivieren die Gene und fördern so die neuronale Differenzierung der aHDFs.
Entfernen Sie das Medium, das die nicht internalisierten Vektoren enthält.
Fügen Sie ein frühes neuronales Umwandlungsmedium hinzu, das Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle enthält, die die Differenzierung in neuronenähnliche Zellen induzieren.
Ersetzen Sie das Medium durch ein spätes neuronales Umwandlungsmedium, das neurotrophe Faktoren für die Reifung zu Neuronen enthält.
Die reifen Neuronen sind bereit für nachgeschaltete Assays.
Bereiten Sie eine zelluläre Suspension von 1.320.000 Zellen in 13,2 Millilitern Fibroblastenmedium vor, um 100.000 Zellen pro Milliliter Medium zu erreichen. Nachdem Sie die Gelatine aus der Platte abgesaugt haben, waschen Sie die Platte zweimal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco. Geben Sie dann 500 Mikroliter Zellsuspension in jede der Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Erwärmen Sie 13,2 Milliliter Fibroblastenmedium auf 37 Grad Celsius. Tauen Sie dann den lentiviralen Vektor in der laminaren Haube bei Raumtemperatur auf. Das erforderliche Volumen an Lentivirus, das zur Infektion der adulten humanen dermalen Fibroblasten bei einer Infektionsmehrheit von 20 erforderlich ist, wird dem Medium ohne Transduktionsverstärker zugegeben.
Ersetzen Sie dann das Medium durch 500 Mikroliter Fibroblastenmedium unter Zugabe des lentiviralen Vektors. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Lentivirus-haltige Medium durch frisches Fibroblastenmedium ohne den lentiviralen Vektor. Am dritten Tag nach der viralen Transduktion entfernen Sie das Fibroblastenmedium und fügen Sie 500 Mikroliter frühes neuronales Konversionsmedium hinzu.
Ersetzen Sie zwei- bis dreimal pro Woche 225 Mikroliter altes Medium aus jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter frisches, frühes neuronales Umwandlungsmedium. Am 18. Tag nach der viralen Transduktion wird das frühe neuronale Umwandlungsmedium entfernt und durch 500 Mikroliter spätes neuronales Umwandlungsmedium ersetzt. Wechseln Sie das Medium wie bisher alle zwei bis drei Tage bis zum 25. Tag oder bis zum experimentellen Endpunkt.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Induktion der neuronalen Differenzierung in adulten humanen dermalen Fibroblasten (aHDFs) mithilfe eines transgenen lentiviralen Vektors beschrieben. Der Prozess umfasst mehrere Stufen des Mediumwechsels und die Zugabe spezifischer Wachstumsfaktoren, um die Reifung zu neuronenähnlichen Zellen zu fördern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gen-Therapie
Hintergrund
- Adulte humane dermale Fibroblasten können in neuronenähnliche Zellen umprogrammiert werden.
- Lentivirale Vektoren werden verwendet, um genetisches Material in Zellen einzuschleusen.
- Die neuronale Differenzierung wird durch spezifische Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle beeinflusst.
- Das Verständnis dieses Prozesses kann der regenerativen Medizin und der Neurobiologie zugutekommen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Umwandlung von aHDFs in Neuronen.
- Untersuchung der Rolle von Transkriptionsfaktoren und shRNAs bei der neuronalen Differenzierung.
- Herstellung eines Protokolls für zukünftige Studien zum Verhalten und zur Funktion von Neuronen.
Verwendete Methoden
- Suspension von aHDFs in Fibroblastenmedium.
- Einführung eines transgenen lentiviralen Vektors für die Genübertragung.
- Sequenzielle Mediumwechsel zur Förderung der neuronalen Differenzierung.
- Verwendung von Wachstumsfaktoren und neurotrophen Faktoren zur Reifung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom.
- Aktivierung von Genen zur neuronalen Differenzierung wurde beobachtet.
- Reife, neuronenähnliche Zellen wurden bis Tag 25 erzeugt.
- Protokoll etabliert für zukünftige neuronale Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen gangbaren Ansatz zur Erzeugung von Neuronen aus Fibroblasten.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der zellulären Umprogrammierung bei.
- Diese Technik könnte Auswirkungen auf regenerative Therapien bei neurodegenerativen Erkrankungen haben.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte Umprogrammierung adulten menschlichen dermalen Fibroblasten in Neuronen ermöglicht einen skalierbaren Zugang zu menschlichen Neuronenmodellen für die frühe Entdeckung und Zielvalidierung. Dieser Ansatz begegnet der Herausforderung, krankheitsrelevante menschliche Neuronen zu beschaffen, und stärkt das Vorhersagevertrauen in neurobiologischen Arbeitsabläufen. Die Methode ermöglicht es F&E-Teams, neuronale Mechanismen zu untersuchen und Risiken in frühen Phasen von Neurowissenschafts-Portfolios zu verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Erzeugung menschlicher Neuronen für mechanistische Studien und die Untersuchung von Signalwegen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem sie einen humanen Zellkontext bereitstellt.
- Erhöht die Vorhersagegenauigkeit in der frühen neurobiologischen Forschung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert eine reproduzierbare Quelle von Neuronen zur Standardisierung und Optimierung von Assays.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der neuronalen Differenzierung und Reifung.
- Unterstützt die Entwicklung skalierbarer Screening-Plattformen zur Evaluierung von Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bietet ein aus menschlichem Gewebe stammendes neuronales System für die translationale Erforschung von Biomarkern.
- Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung anhand krankheitsrelevanter Zellmodelle.
- Verringert die Abhängigkeit von nicht-menschlichen Systemen für die mechanistische Risikominimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Reprogrammierungs-Workflow integriert sich in die Entdeckungskette von der frühen Hypothesenprüfung über die Assay-Entwicklung bis hin zur präklinischen Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt hypothesengeleitete Untersuchungen zur neuronalen Differenzierung und Genfunktion.
- Screening: Stellt standardisierte neuronale Populationen für reproduzierbare Assayausgaben bereit.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung neuronaler Marker und der Differenzierungseffizienz.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität bei der Validierung von Biomarkern in humanen neuronalen Systemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Generierung von Neuronen aus diversen Spenderhintergründen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in neuronalen Studien.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Neuronengenerierung, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über Projekte hinweg zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühzeitige, für den Menschen relevante Daten generiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Neurobiologie-Assets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der lentiviralen Transduktion und der Kultur neuronaler Zellen.
- Benötigt Zugang zu einer Biosicherheitsinfrastruktur für den Umgang mit viralen Vektoren.
- Setzt eine standardisierte Differenzierungsprotokollabstimmung zwischen Teams voraus.
- Kann eine Anpassung an verschiedene Fibroblastenquellen oder Spendervariabilität erfordern.
- Hängt von der quantitativen Validierung der neuronalen Identität und Reife ab.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026