Generierung von Neuronen durch Reprogrammierung menschlicher dermaler Fibroblastenzellen

Führen Sie adulte humane dermale Fibroblasten oder aHDFs, die in einem Fibroblastenmedium suspendiert sind, in eine mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtete Mikroplatte ein. Inkubieren, um die Zelladhärenz zu ermöglichen.

Einführung eines transgenen lentiviralen Vektors. Bei der Internalisierung in die Wirtszelle wird die virale RNA in DNA reverse-transkribiert, die sich in das Wirtsgenom integriert.

Die virale DNA exprimiert Transkriptionsfaktoren und kurze Haarnadel-RNAs oder shRNAs. Zelluläre Nukleasen verarbeiten die shRNAs zu kleinen interferierenden RNAs oder siRNAs.

Die erzeugten siRNAs bauen die mRNA ab, die für transkriptionelle Repressoren kodiert, wodurch deren Expression gehemmt und die Aktivierung von neuronalen Differenzierungsgenen ermöglicht wird.

Die Transkriptionsfaktoren aktivieren die Gene und fördern so die neuronale Differenzierung der aHDFs.

Entfernen Sie das Medium, das die nicht internalisierten Vektoren enthält.

Fügen Sie ein frühes neuronales Umwandlungsmedium hinzu, das Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle enthält, die die Differenzierung in neuronenähnliche Zellen induzieren.

Ersetzen Sie das Medium durch ein spätes neuronales Umwandlungsmedium, das neurotrophe Faktoren für die Reifung zu Neuronen enthält.

Die reifen Neuronen sind bereit für nachgeschaltete Assays.

Bereiten Sie eine zelluläre Suspension von 1.320.000 Zellen in 13,2 Millilitern Fibroblastenmedium vor, um 100.000 Zellen pro Milliliter Medium zu erreichen. Nachdem Sie die Gelatine aus der Platte abgesaugt haben, waschen Sie die Platte zweimal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco. Geben Sie dann 500 Mikroliter Zellsuspension in jede der Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Erwärmen Sie 13,2 Milliliter Fibroblastenmedium auf 37 Grad Celsius. Tauen Sie dann den lentiviralen Vektor in der laminaren Haube bei Raumtemperatur auf. Das erforderliche Volumen an Lentivirus, das zur Infektion der adulten humanen dermalen Fibroblasten bei einer Infektionsmehrheit von 20 erforderlich ist, wird dem Medium ohne Transduktionsverstärker zugegeben.

Ersetzen Sie dann das Medium durch 500 Mikroliter Fibroblastenmedium unter Zugabe des lentiviralen Vektors. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Lentivirus-haltige Medium durch frisches Fibroblastenmedium ohne den lentiviralen Vektor. Am dritten Tag nach der viralen Transduktion entfernen Sie das Fibroblastenmedium und fügen Sie 500 Mikroliter frühes neuronales Konversionsmedium hinzu.

Ersetzen Sie zwei- bis dreimal pro Woche 225 Mikroliter altes Medium aus jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter frisches, frühes neuronales Umwandlungsmedium. Am 18. Tag nach der viralen Transduktion wird das frühe neuronale Umwandlungsmedium entfernt und durch 500 Mikroliter spätes neuronales Umwandlungsmedium ersetzt. Wechseln Sie das Medium wie bisher alle zwei bis drei Tage bis zum 25. Tag oder bis zum experimentellen Endpunkt.