Erzeugung und Pflege von Schnittkulturen aus humanem Glioblastomgewebe
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 4:13 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir menschliches Glioblastomgewebe, einen primären Hirntumor, der aus Gliazellen stammt.
Waschen Sie das Tuch mit einem eiskalten Verarbeitungsmedium, um Blutreste zu entfernen.
Schneiden Sie das Gewebe in Stücke und legen Sie es in eine Einbettform mit geschmolzener Agarose.
Kühle die Form, damit die Agarose polymerisieren und eine stabile Gelmatrix bilden kann.
Entfernen Sie den Gewebeblock aus der Form und fixieren Sie ihn auf der Probenplatte eines Vibratoms.
Fügen Sie das eiskalte Verarbeitungsmedium hinzu, um den Block einzutauchen. Lassen Sie ein sauerstoffreiches Gasgemisch passieren, um das Medium zu belüften und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
Teilen Sie das eingebettete Tumorgewebe in dünne Scheiben.
Übertragen Sie eine Scheibe in eine Petrischale mit dem eiskalten Verarbeitungsmedium, um die Gewebearchitektur zu erhalten.
Plattieren Sie dann die Gewebescheibe auf einem durchlässigen Membraneinsatz in einer Vertiefung, die ein Scheibenkulturerhaltungsmedium enthält.
Halten Sie die Scheibe unter physiologischen Bedingungen. Die Schnittkultur ist bereit für nachgelagerte Assays.
Beginnen Sie damit, leere PTFE-Kultureinsätze mit einer sterilen Pinzette in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu platzieren, die 1 Milliliter Scheibenkulturerhaltungsmedium pro Vertiefung enthält. Wenn alle Einsätze hinzugefügt wurden, legen Sie die Platte in einen befeuchteten, wasserummantelten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
Legen Sie anschließend die Tumorgewebestücke in eine Petrischale mit eiskaltem Verarbeitungsmedium und waschen Sie das Gewebe mit einer Pipette dreimal vorsichtig mit frischem Medium, um anhaftende rote Blutkörperchen zu entfernen. Schneiden Sie nach der dritten Wäsche die Tumorstücke mit einem Skalpell in etwa 3 x 3 x 10 Millimeter große Streifen, entfernen Sie vorsichtig alle anhaftenden Gefäße und vermeiden Sie nekrotisches oder kauterisiertes Gewebe
.Wenn das gesamte Gewebe abgeschnitten ist, geben Sie 5 bis 7 Milliliter 37 Grad Celsius flüssige Agarose in eine 2 Kubikzentimeter große Kunststoffeinbettungsform und kühlen Sie die Agarose eine Minute lang auf einem Eisbett. Legen Sie 2 bis 4 Streifen Gewebe in die Agarose, wobei die Längsachse vertikal ausgerichtet ist, und lassen Sie die Gewebe nach dem Platzieren weitere 2 bis 5 Minuten auf Eis.
Wenn die Agarose fest geworden ist, schneiden Sie die Seiten der Form mit einem Skalpell ab, um die Agarose vorsichtig aus der Form zu entfernen, und verwenden Sie einen großzügigen Tropfen Cyanacrylatkleber, um den Agaroseblock auf einer Vibratom-Probenplatte zu befestigen.
Wenn der Kleber ausgehärtet ist, tauchen Sie den Agaroseblock in eiskaltes Verarbeitungsmedium und sprudeln Sie mit einer getrimmten, sterilen Kunststoffpipette ein Gemisch von 5 % CO2 95 % O2 in das Medium im Vibratom-Reservoir. Stellen Sie die Dicke der Vibratomscheibe auf 300 bis 350 Mikrometer ein und passen Sie die erweiterte Geschwindigkeit der Klinge und die Klingenamplitude entsprechend der Gewebekonsistenz und den Vibrationsspezifikationen an.
Erhalten Sie die entsprechende Anzahl von Scheiben entsprechend der geplanten experimentellen Analyse. Mit einem Mikrospatel aus Edelstahl werden die Scheiben bei der Aufnahme in eine Petrischale mit eiskaltem Verarbeitungsmedium überführt. Wenn alle Scheiben aufgenommen wurden, übertragen Sie mit dem Mikrospatel jede Scheibe auf einen einzelnen PTFE-Einsatz.
Nach einer 12- bis 24-stündigen Inkubation äquilibrieren Sie eine neue Sechs-Well-Platte mit frischem Scheibenkulturerhaltungsmedium für 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Fassen Sie dann jeden Einsatz mit einer sterilen Pinzette am Rand und übertragen Sie die Einsätze in einzelne Vertiefungen der neuen Sechs-Well-Platte.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Vorbereitung von menschlichem Glioblastomgewebe für die Schnittkultur beschrieben. Das Verfahren umfasst das Einbetten des Gewebes in Agarose und das Anfertigen von Schnitten für nachgeschaltete Analysen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Onkologie
Hintergrund
- Glioblastom ist ein primärer Hirntumor, der von Gliazellen ausgeht.
- Die Aufrechterhaltung der Gewebeviabilität ist entscheidend für genaue experimentelle Ergebnisse.
- Schnittkulturen ermöglichen die Untersuchung der Tumorbiologie in einem kontrollierten Umfeld.
- Angemessene Einbettungs- und Schnitttechniken sind entscheidend, um die Gewebearchitektur zu erhalten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Herstellung von Glioblast-Gewebeschnitten.
- Ermöglichung nachgeschalteter Analysen, die lebensfähige Gewebeproben erfordern.
- Verbesserung des Verständnisses der Glioblast-Biologie mithilfe von Schnittkultivierungstechniken.
Verwendete Methoden
- Menschliches Glioblastomgewebe wird gewaschen und in Agarose eingebettet.
- Das eingebettete Gewebe wird mit einem Vibratom geschnitten.
- Die Schnitte werden in einem Pflegemedium unter physiologischen Bedingungen kultiviert.
- Bebrütungs- und Transfertechniken werden angewandt, um die Gewebeviabilität sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von Glioblastom-Gewebeschnitten für die Kultur.
- Erhaltung der Geweearchitektur und Vitalität während des gesamten Verfahrens.
- Entwicklung eines Protokolls für nachgeschaltete Assays unter Verwendung von Schnittkulturen.
- Nachweis der Durchführbarkeit der Vibratomschnitte bei Tumorgewebe.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz für die Glioblastom-Schnittkultur.
- Die Aufrechterhaltung der Gewebeviabilität ist entscheidend für die experimentelle Integrität.
- Diese Technik kann zur Untersuchung der Glioblastom-Biologie und der Behandlungsreaktionen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Organotypische Schnittkulturen aus menschlichem Glioblastomgewebe bieten eine physiologisch relevante Plattform, um die Tumorbiologie und die Reaktion auf Medikamente in einem patientenspezifischen Kontext zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es translationsorientierten Forschungsteams, antiinvasive Wirkstoffe und mechanistische Hypothesen in einem System zu evaluieren, das die native Gewebearchitektur erhält. Die frühe Integration solcher Modelle in den Entdeckungsprozess stärkt die Vorhersagekraft und verringert das Risiko bei nachfolgenden präklinischen Entscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Überprüfung therapeutischer Hypothesen in intakten humanen Tumormikroumgebungen.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Invasion und Progression von Glioblastomen beteiligt sind.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Erhaltung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für die Portfolioauswahl durch Modellierung patientenspezifischer Reaktionen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes ex-vivo-System zur quantitativen Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf Tumorschnitte.
- Unterstützt die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays durch kontrollierte Gewebepräparation und -pflege.
- Ermöglicht das Screening von antiinvasiven Wirkstoffen in einem krankheitsrelevanten Kontext.
- Erlaubt die skalierbare Herstellung mehrerer Schnitte aus einer einzigen Tumorprobe.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht translationalen Biomarker-Strategien, da die native Tumorarchitektur und Heterogenität erhalten bleibt.
- Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem funktionelle Untersuchungen an humanem Gewebe ermöglicht werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf patientenspezifischen Arzneimittelwirkungsdaten.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung von Therapiekandidaten vor In-vivo-Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Schnittkulturmethode fügt sich zwischen die frühe Entdeckung und die präklinische Validierung ein und ermöglicht die Hypothesenprüfung, Zielstrukturbeurteilung und Substanzscreening in einem humanen Gewebekontext.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Überprüfung der Nullhypothese und die Untersuchung von Signalwegen in intakten Tumorschnitten.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Bewertung von Substanzen in standardisierter Form.
- Analytik: Ermöglicht die Messung der Wirkstoffeffekte auf Tumormigration und -viabilität unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Erhält die Krankheitsrelevanz und Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Bewertung aufrecht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Arbeitsablauf für mehrere Patientenproben und Wirkstoffkandidaten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Glioblastomforschung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebeaufbereitung und Kultur für reproduzierbare und skalierbare Studien.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühe Entwicklungsprojekte entrisikot werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf patientenspezifischen funktionellen Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Gewebe, Einbetten und Schneiden am Vibratom.
- Benötigt Zugang zu Vibratom-Geräten und kontrollierten Kulturbedingungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg zur Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten voraus.
- Kann je nach Tumortyp oder Gewebekonsistenz Anpassungen erfordern.
- Die Vitalität und Architektur der Schnitte müssen überwacht werden, um die experimentelle Integrität sicherzustellen.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026