Entwicklung eines Dreifachzellkulturmodells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke

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Neurowissenschaften

0 Ansichten • 3:44 Min. • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit dem Hinzufügen von Perizyten an der Unterseite des Well-Einsatzes.

Decken Sie die Vertiefung mit einer Kulturplatte ab und inkubieren Sie.

Perizyten heften sich an die Membran des Well-Inserts und bilden eine einzellige Schicht oder eine Monoschicht.

Nimm eine weitere Kulturplatte.

Geben Sie menschliche Astrozyten in einem geeigneten Medium in die Vertiefung. Inkubieren Sie dann die Platte.

Astrozyten heften sich am Boden der Vertiefung an und bilden eine Monoschicht.

Entsorgen Sie das Medium und fügen Sie frischen Astrozyten und Perozytenmedium hinzu.

Nehmen Sie nun die Kulturplatte, die den Well-Insert mit der Perinozytenschicht enthält.

Drehen Sie die Platte um und übertragen Sie den Well-Einsatz in die Well, die die Astrozytenschicht enthält.

Geben Sie die Endothelzellen des menschlichen Gehirns an die Oberseite der Vertiefung, setzen Sie sie ein und inkubieren Sie.

Die Endothelzellen heften sich an den Well-Einsatz und bilden ein Dreifachzellkultursystem, das der Blut-Hirn-Schranke ähnelt, einer entscheidenden Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Gehirn.

Beginnen Sie mit der Kultivierung von HBVP in T75-Kulturkolben mit einer aktivierten Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, bis es konfluent ist. Sobald die Konfluenz erreicht ist, aspirieren Sie das alte Parasitenmedium und waschen Sie die Zellen mit 5 Millilitern warmem Dulbecco's PBS. Das PBS von Dulbecco wird aspiriert und die Zellen aus dem Kolben gelöst, wobei eine Kombination aus 4 Millilitern warmer Trypsin-EDTA-Lösung und 1 Milliliter PBS von Dulbecco

verwendet wird.

Inkubieren Sie den Kolben 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Betrachten Sie unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, ob sich die Zellen vom Kolben gelöst haben. 5 Milliliter warmes Parasitenmedium mit 2 % FBS werden in den Kolben gegeben und die abgelösten Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellsuspension wird drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, so dass die Zellen am Boden des Röhrchens ein Pellet bilden.

Saugen Sie das Medium aus dem Rohr an und stellen Sie sicher, dass das Zellpellet intakt bleibt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Parasitenmedium. Berechnen Sie die Menge des Mediums, abhängig von der Konfluenz der Zellen und der Anzahl der benötigten Well-Einsätze. Nehmen Sie 10 Mikroliter der resuspendierten Zellen. Legen Sie sie in eine Folie für die Zellzählung und zählen Sie die Anzahl der Zellen.

Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Einsatz in 1 Milliliter Parasitenmedium auf die luminale Seite der Well-Einsätze. Kultivieren Sie primäre humane Astrozyten unter Verwendung des Astrozytenmediums, das 2% FBS enthält, wie im Textmanuskript beschrieben. Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Well auf den Boden der 6-Well-Platten der Gewebekultur. Decken Sie die Platte ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie sie über Nacht.

Entnehmen Sie die 6-Well-Platten der Gewebekultur mit Astrozyten in den Well-Einsätzen mit Perizyten aus dem Inkubator. Aspirieren Sie das Astrozytenmedium aus den 6-Well-Platten der Gewebekultur und geben Sie 1 Milliliter Parasitenmedium und 1 Milliliter Astrozytenmedium in jede Vertiefung

.

Aspirieren Sie das Perizytenmedium aus den Well-Einsätzen und legen Sie es in die 6-Well-Platten der Gewebekultur, die die ausgesäten Astrozyten enthalten. HBMEC mit einer Dichte von 300.000 Zellen pro Vertiefung in 2 Millilitern vollständigem klassischem Medium auf die apikale Seite der gleichen Well-Einsätze aussäen.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026