Ein Hydrogel auf Hyaluronsäurebasis für die 3-dimensionale Kultur von Glioblastomzellen

Beginnen wir mit den Gliomsphären, Zellaggregaten, die von einem Hirntumor oder Glioblastom abgeleitet sind.

Dissoziationsenzyme hinzufügen. Inkubieren, um die Glioblastomzellen zu trennen und eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Führen Sie als Nächstes ein mit Serum angereichertes Nährmedium ein, um die Enzymaktivität zu stoppen.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen, dann die Zellen wieder suspendieren.

Die Suspension filtrieren, dann zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in Hydrogel-Vorläufern, die kleine Peptide enthalten.

Laden Sie diese Mischung mit einer vormontierten Silikonform, die Hyaluronsäure enthält, in Vertiefungen.

Mischen Sie die Lösung. Inkubieren, um die Wechselwirkung zwischen der Hyaluronsäure und den Hydrogel-Vorläufern zu ermöglichen und ein Hydrogel zu bilden, das die Zelleinschlussung erleichtert.

Überlagern Sie das Hydrogel mit Kulturmedien, um das Überleben der Zellen zu erhalten.

Nachdem Sie die Form zerlegt haben, inkubieren Sie das Hydrogel.

Innerhalb des Hydrogels interagieren die Adhäsionsproteine auf den Zellen mit den Vorläuferpeptiden und der Hyaluronsäure.

Dies führt dazu, dass sich Zellen zu kleinen Clustern bilden und eine dreidimensionale Kultur entwickeln.

Setzen Sie zunächst saubere, trockene Silikonkautschukformen in jede Vertiefung einer nicht mit Gewebekulturen behandelten 12-Well-Platte ein und kleben Sie die Formen mit dem sauberen stumpfen Ende einer Pipettenspitze an den Boden der Platte. Nachdem Sie die Dichtung zwischen den Formen und den Vertiefungsböden überprüft haben, sammeln Sie die dissoziierten Gliomkugeln aus einer Glioblastom-Zellkultur durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zelldissoziationsenzym

Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wird das Röhrchen durch sanftes Klopfen gerührt und die enzymatische Reaktion mit vier Millilitern des vollständigen Mediums gestoppt. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Medium, bevor Sie die Zellen durch einen 70-Mikrometer-Filter abseihen. Waschen Sie das Sieb mit weiteren vier Millilitern Vollmedium und teilen Sie die Suspension in zwei Aliquots von 8 x 10⁴ Zellen pro Zentrifugenröhrchen auf.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie ein Pellet in 80 Mikrolitern frisch zubereitetem Polyethylenglykolmaleimid oder PEG-Mal-RGD und ein Pellet in 80 Mikrolitern frisch zubereiteter PEG-Mal-CYS-Lösung pro Form. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit breiter Öffnung 40 Mikroliter Hyaluronsäurelösung in jede Gummisilikonform, gefolgt von 40 Mikrolitern entweder der PEG-Mal-CYS- oder der PEG-Mal-RGD-Zelllösung, wobei Sie zum Mischen nicht mehr als 10 Mal pro Form schnell auf und ab pipettieren.

Aufgrund der schnellen Gelierungszeit ist es wichtig, nach dem Mischen der beiden Hydrogelkomponenten eine Pipettenspitze mit breiter Öffnung zu verwenden, um die Lösungen schnell und dennoch gründlich miteinander zu mischen. Dieser Schritt erfordert Übung.

Legen Sie dann die gelverkapselten Zellen für 5 bis 10 Minuten in einen 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ -Zellkultur-Inkubator. Geben Sie am Ende der Inkubation 2 bis 2,5 Milliliter Nährmedium zu jedem Gel und trennen Sie die Gele mit einer sterilen Zwei-Mikroliter-Pipettenspitze und einer Pinzette vorsichtig von den Seiten der Formen. Verwenden Sie dann eine sterilisierte Pinzette, um die Formen aus den Plattenvertiefungen zu entfernen und die Platte wieder in den Zellinkubator zu stellen.