Analyse des Überlebens von Purkinje-Zellen in organotypischen Kleinhirnschnittkulturen

Beginnen Sie mit dem Gehirn eines Mäusewelpen.

Isolieren Sie das Kleinhirn und erhalten Sie Gewebescheiben mit angemessener Dicke.

Übertragen Sie die Scheiben auf Membraneinsätze, die sich in Kulturplattenvertiefungen mit Medien befinden.

In behandelten Vertiefungen enthält das Medium eine neuroprotektive Testverbindung. In Kontrollbohrungen fehlt die Verbindung. Ausbrüten.

Unter Kontrollbedingungen durchlaufen die kleinhirnären Purkinje-Zellen eine Apoptose, die die frühe postnatale Entwicklung in vivo nachahmt.

In behandelten Vertiefungen kann die Verbindung je nach ihrem Potenzial die Zellen vor Apoptose schützen.

Waschen Sie die Scheiben und fixieren Sie sie, um die Zellintegrität zu erhalten.

Übertragen Sie die Scheiben in eine Permeabilisierungs-Blockierungslösung, um die Zellmembranen zu permeabilisieren und unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.

Overlay mit primären Antikörpern, die auf ein Kalziumbindungsprotein abzielen, das spezifisch in Purkinje-Zellen exprimiert wird.

Waschen und einführen Sie fluorophorkonjugierte Sekundärantikörper, die auf die Primärantikörper abzielen.

Färben Sie die Zellkerne mit einem DNA-bindenden Farbstoff gegengefärbt und montieren Sie die Scheiben.

Quantifizieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop die lebensfähigen Purkinje-Zellen, um das neuroprotektive Potenzial der Testsubstanz zu identifizieren

Um das Kleinhirn zu entnehmen, fassen Sie den Kopf des Welpen mit einer geraden Verbandzange an der Nase und schneiden Sie die Kopfhaut mit einer geraden Augenschere vom hinteren Ende seitlich bis zur Mittellinie auf. Schneiden Sie den Schädel auf die gleiche Weise auf, indem Sie die Scherenspitzen nach außen zeigen, um das Kleinhirn nicht zu beschädigen, und übertragen Sie das Gehirn mit einem Spatel in eine 60-Millimeter-Schale, die kaltes HBSS und 5 Milligramm pro Milliliter Glukose enthält.

Verwenden Sie die gerade Verbandszange, um das Kleinhirn vorsichtig zu präparieren, und legen Sie das Gewebe mit einer steril gebogenen, feinen Pinzette auf eine Plastikscheibe auf dem Schneidetisch eines Gewebezerkleinerers. Drehen Sie den Schneidetisch, um das Gewebe so auszurichten, dass parasagittale Schnitte aufgenommen werden können, und ziehen Sie den Entriegelungsknopf des Tisches nach rechts, um den Schneidetisch zu bewegen, bis die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist. Stellen Sie dann die Scheibendicke auf 350 Mikrometer und die Messergeschwindigkeit auf mittel ein und starten Sie den Zerkleinerer. Wenn das ganze Kleinhirn aufgeschnitten ist, schalten Sie den Zerkleinerer aus.

Halten Sie die Scheibe mit einer sterilen Pinzette über eine neue 60-Millimeter-Schale. Spülen Sie mit einer Transferpipette HBSS plus Glukose über die Scheibe, so dass die Scheiben in die Schale fallen. Berühren Sie dann die Proben so wenig wie möglich und verwenden Sie eine Mikrosonde, um die Scheiben zu trennen.

Verwenden Sie die Transferpipette, um die Abschnitte des Kleinhirns in der Nähe des Vermis auf einzelne Zellkultureinsätze in der Sechs-Well-Platte auszuwählen, und positionieren Sie die Scheiben mit der Mikrosonde in der Mitte jedes Einsatzes. Wenn alle Scheiben platziert sind, saugen Sie überschüssiges HBSS plus Glukose vorsichtig ab und geben Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Für die Immunfluoreszenzfärbung entfernen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Einsätze mit PBS. Fixieren Sie die Scheiben mit 1 Milliliter kaltem 4%igem Paraformaldehyd in der Vertiefung jeder Einlage und 500 Mikrolitern auf jeder Einlage für 1 Stunde.

Waschen Sie die Einlagen am Ende der Fixierung viermal für 10 Minuten mit 1 Milliliter frischem PBS unter jedem Einsatz und 500 Mikrolitern frischem PBS auf jedem Einsatz pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler. Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern PBS-TB vor und übertragen Sie mit einem Pinsel die Kleinhirnscheiben von jedem Zellkultureinsatz in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur für eine Stunde. Am Ende der Inkubation markieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern des primären Antikörpers von Interesse, verdünnt in PBS-TB pro Vertiefung über Nacht bei 4 Grad Celsius auf dem Orbitalschüttler.

Am nächsten Morgen waschen Sie die Scheiben viermal für 10 Minuten und 500 Mikroliter frisches PBS pro Waschgang auf dem Shaker, bevor Sie die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem lichtgeschützten Shaker mit den entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern markieren.

Am Ende der Inkubation werden die Schnitte 10 Minuten lang bei lichtgeschützter Raumtemperatur mit 500 Mikrolitern einer geeigneten Kernfärbung pro Vertiefung gegengefärbt und mit einer Transferpipette auf Objektträger montiert.

Lassen Sie die Schnitte dann vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie sie mit PBS rehydrieren und die Gewebe mit Deckgläsern befestigen, die mit etwa 80 Mikrolitern Eindeckmedium beschichtet sind. Sobald das Eindeckmedium ausgehärtet ist, können die Kleinhirnabschnitte abgebildet werden.