Dissoziation und Kultivierung von Neuronen aus Gewebeproben des Hippocampus
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:35 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit Gewebeproben des Hippocampus, die Neuronen und verschiedene nicht-neuronale Zellen enthalten.
Fügen Sie eine Protease-Enzymlösung hinzu. Das Enzym baut die extrazelluläre Matrix des Gewebes ab und leitet so die Zelldissoziation ein.
Mit einem Beschichtungsmedium waschen, um Enzymreste zu entfernen.
Pipettieren Sie das verdaute Gewebe wiederholt, um die Zellen mechanisch vom Gewebe zu trennen und eine Einzelzellsuspension zu bilden.
Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen im Beschichtungsmedium.
Säen Sie die Zellen auf ein mit Poly-D-Lysin beschichtetes Deckglas in einer Multi-Well-Platte. Lysin verbessert die Zelladhäsion.
Ersetzen Sie das Beschichtungsmedium durch ein Neuronenerhaltungsmedium, das essentielle Nährstoffe für das Überleben der Neuronen enthält.
Frischen Sie die Hälfte des Mediums mit Erhaltungsmedien auf, die Arabinosylcytosin oder Ara-C enthalten.
Ara-C dringt in die Zellen ein und hemmt selektiv das Wachstum nicht-neuronaler Zellen, was zu deren Tod führt.
Ersetzen Sie das Medium durch frische Erhaltungsmedien, um das Überleben der Neuronen zu unterstützen.
Um die Hippocampus-Neuronen für die Kultur zu dissoziieren, tauen Sie die Protease-Enzymlösung auf und wärmen Sie das Beschichtungsmedium auf 37 Grad Celsius vor. Spülen Sie anschließend den präparierten Hippocampus mit SLDS ab. Entfernen Sie es dann, fügen Sie 2 Milliliter Protease-Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie anschließend die Hippocampus-Explantate zweimal mit 5 bis 10 Millilitern Beschichtungsmedium und fügen Sie 5 Milliliter Beschichtungsmedium hinzu. Dissoziieren Sie die Hippocampus-Explantate in einzelne Zellen, indem Sie mit einer Pipette mit einer 1-Milliliter-Kunststoffspitze einen kleinen Wirbel erzeugen. Pipettieren Sie etwa 40 Mal auf und ab und vermeiden Sie die Bildung von Sauerstoffblasen, bis die Lösung trüb wird und keine großen Explantatstücke mehr übrig bleiben.
Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen 3 Minuten lang bei der 1.125-fachen Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit den in Medium getauchten Zellen und resuspendieren Sie die Zellen in 145 Millilitern Beschichtungsmedium. Geben Sie dann 1 Milliliter der Zellsuspension pro Vertiefung auf eine 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen im Beschichtungsmedium bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden.
Entfernen Sie anschließend das Beschichtungsmedium und ersetzen Sie es durch frisches Pflegemedium. Ersetzen Sie nach zwei Tagen die Hälfte des Mediums durch zwei mikromolare Ara-C, die in Erhaltungsmedium gelöst sind, um das Wachstum von Fibroblasten, Endothel- und Gliazellen zu hemmen. Nachdem Sie die Zellen zwei Tage lang Ara-C ausgesetzt haben, ersetzen Sie das Medium durch frisches Erhaltungsmedium.
Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Dissoziation hippocampaler Neuronen aus Gewebeproben für die Kultur beschrieben. Es werden die Schritte zur Vorbereitung der Zellen für die Aufrechterhaltung und das Wachstum in vitro erläutert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellkultur
- Neuronale Biologie
Hintergrund
- Hippocampale Neuronen sind entscheidend für die Untersuchung verschiedener neurologischer Funktionen.
- Zelldissoziationstechniken sind unerlässlich, um Neuronen von nicht-neuronalen Zellen zu isolieren.
- Die sachgemäße Pflege neuronaler Kulturen ist für die experimentelle Genauigkeit von entscheidender Bedeutung.
- Die Verwendung von Ara-C hilft dabei, das Wachstum nicht-neuronaler Zellen selektiv zu hemmen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Methodik zur Isolierung hippocampaler Neuronen bereitzustellen.
- Das Verständnis neuronaler Zellkultivierungstechniken zu vertiefen.
- Das Überleben und die Erhaltung kultivierter Neuronen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von hippocampalen Gewebeproben.
- Verwendung einer Protease-Enzymlösung zur Gewebe-Dissociation.
- Mechanische Dissociation zur Erzeugung einer Einzelzell-Suspension.
- Anwendung von Ara-C zur Hemmung des Wachstums nicht-neuronaler Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Dissoziation von Neuronen aus hippocampalem Gewebe.
- Effektive Erhaltung neuronaler Kulturen über die Zeit.
- Nachgewiesene selektive Hemmung nicht-neuronaler Zellen mittels Ara-C.
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung und Kultur hippocampaler Neuronen.
- Die Verwendung von Ara-C ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der neuronalen Reinheit.
- Diese Methodik kann auf verschiedene Untersuchungen in der Neurowissenschaft angewandt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die zuverlässige Dissoziation und Kultur hippokampaler Neuronen ermöglicht die Erstellung standardisierter, neuronenangereicherter in-vitro-Systeme für die frühe Phase der neurowissenschaftlichen Wirkstoffforschung. Diese Kulturen bieten eine kontrollierte Plattform zur Untersuchung neuronaler Mechanismen und unterstützen eine vorhersagbare Aussagekraft bei der Zielvalidierung und der mechanistischen Risikominimierung. Die Selektivität des Verfahrens für neuronale Populationen verbessert die Translation und Entscheidungsfindung im Portfolio bei neurobiologisch ausgerichteten Entwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Isolierung reiner neuronaler Populationen für hypothesengetriebene Studien.
- Unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem nicht-neuronale Störfaktoren minimiert werden.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung in krankheitsrelevanten neuronalen Systemen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die frühe Selektion von Projekten im Portfolio.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht reproduzierbare Neuronenkulturen zur Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die quantitative Messung neuronaler Reaktionen auf Substanzen.
- Unterstützt Skalierbarkeit und die Wiederverwendung von Plattformen für Screening-Kampagnen.
- Verringert die Variabilität, indem die Interferenz nicht-neuronaler Zellen begrenzt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro-Modelle mit der krankheitsrelevanten neuronalen Biologie ab.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen zum Fortschreiten basierend auf neuronenspezifischen Daten.
- Erleichtert die Biomarker-Exploration in neuronenangereicherten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Dissoziation und Kultivierung von Neuronen liegt an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckungsforschung und Assay-Entwicklung und stellt grundlegende Systeme für nachgeschaltete Screening- und Mechanismus-Studien bereit.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in neuronenspezifischen Kontexten.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative neuronale Assays zur Bewertung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht die Messung der neuronalen Vitalität und Reaktion und unterstützt den statistischen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft eine Brücke zu präklinischen Modellen, indem neuronale Reinheit und Relevanz erhalten bleiben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Workflow, der für verschiedene Neurowissenschaftsprojekte anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in neuronalen Studien.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Neuronenkultur-Arbeitsabläufen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste neuronale Assays ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Neurobiologie-Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Setzt Fachkenntnisse im Umgang mit neuronalem Gewebe und ZellkulturmMethoden voraus.
- Erfordert Zugang zu Protease-Enzymlösungen, mit Poly-D-Lysin beschichteten Platten und kontrollierten Inkubationsumgebungen.
- Erfordert eine Standardisierung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um die Reproduzierbarkeit in multizentrischen Studien zu gewährleisten.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene neuronale Subtypen oder Spezies erforderlich.
- Hängt von der effektiven Entfernung nicht-neuronaler Zellen ab, um eine optimale Leistung des Assays zu erreichen.
Biopharma-Häufige Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026