JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 4:00 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit der Aussaat menschlicher embryonaler Stammzellen auf einer matrixbeschichteten Multiwell-Platte.
Die Matrixumgebung verhindert eine vorzeitige Reifung zu einer spezialisierten Zelle.
Fügen Sie ein geeignetes Erhaltungsmedium hinzu, das mit Dimethylsulfoxid oder DMSO ergänzt ist.
Die DMSO-Behandlung verstärkt die Reaktion der Zellen auf Reifungssignale.
Ersetzen Sie als Nächstes das Medium durch ein neuronales Induktionsmedium, das spezifische Inhibitoren enthält.
Inhibitoren blockieren die Signale der nicht-neuralen Zellentwicklung und leiten die Stammzellen an, sich in neuronale Vorläuferzellen oder NPCs zu verwandeln.
Ersetzen Sie das Medium durch eine Ablösung, um die NPCs zu dissoziieren. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen auf eine andere Multiwell-Platte auf.
Fügen Sie ein zellspezifisches Differenzierungsmedium hinzu, das mit DMSO ergänzt wird, um die Umwandlung von NPCs in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs zu fördern.
Ersetzen Sie das Medium durch ein zellspezifisches Reifungsmedium, um die Entwicklung von OPCs zu Oligodendrozyten zu erleichtern.
Um die Generierung neuraler Vorläuferzellen durchzuführen, kultivieren Sie H1-humane ES-Zellen und transdifferenzieren sie in neurale Vorläuferzellen, wie im Textmanuskript beschrieben. Am negativen Tag 1 säen Sie 0,5 bis 1 Million Zellen in ES-Zellerhaltungsmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit Wachstumsfaktor-reduzierter Matrixlösung beschichtet ist.
Behandeln Sie die Zellen am Tag Null 24 Stunden lang mit ES-Zellerhaltungsmedium, ergänzt mit 2 % DMSO. Wechseln Sie an den Tagen 1 bis 6 das gesamte Medium durch ein warmes neuronales Induktionsmedium, das SMAD-Inhibitoren aus einem kommerziellen Kit enthält. An Tag 7 werden NPCs mit Zellablösungslösung durchquert und mit einer Sitzdichte von 1 bis 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte plattiert.
Um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu erzeugen, plattieren Sie die NPCs in warmem neuronalem Induktionsmedium mit SMAD-Inhibitoren aus einem kommerziellen Kit. Bereiten Sie an Tag 8 eine Lösung von 1 % DMSO im OPC-Differenzierungsmedium vor und behandeln Sie die plattierten NPCs 24 Stunden lang. Ersetzen Sie das Medium an Tag 9 durch frisches OPC-Differenzierungsmedium ohne DMSO und füttern Sie die Zellen dann jeden zweiten Tag bis zum Tag 15.
Wenn die Zellen vor dem 15. Tag die Konfluenz erreichen, werden sie auf die Aussaatdichte von 1 bis 2 x 105 Zellen pro Vertiefung gebracht. An Tag 14 werden OPCs in OPC-Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 1 bis 2 x 105 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte plattiert. Ersetzen Sie das Medium am 15. Tag durch das OL-Reifemedium.
Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag oder jeden Tag. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, teilen Sie sie in einem Verhältnis von 1 zu 3 für bis zu zwei Passagen oder bis sich die Zellteilung erheblich verlangsamt. Wenn sich OPCs zu schnell teilen und in weniger als drei Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Ara-C in einer Konzentration von 2 bis 5 Mikromolaren für ein bis drei Tage hinzu.