Eine Technik zur Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Beginnen Sie mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellkolonien, die auf einer adhärenten Basalmembranmatrix kultiviert werden.

Fügen Sie ein Kleinhirn-Differenzierungsmedium hinzu, das ein spezifisches Hormon, einen Wachstumsfaktor und niedermolekulare Inhibitoren enthält.

Heben Sie die Kolonien mit einer Glaspipette an und übertragen Sie sie auf eine extrem niedrige Befestigungsplatte.

Die Oberfläche mit geringer Bindung hält die Zellen in Suspension und erleichtert ihre Aggregation zu dreidimensionalen Embryoidkörpern (EBs).

Das Hormon, der Wachstumsfaktor und die Inhibitoren binden an ihre jeweiligen Zielstellen und fördern so die Differenzierung der Stammzellen in neuronale Vorläuferzellen.

Übertragen Sie die EBs in Kulturplatten-Wells, die mit einem synthetischen Polymer und einem Adhäsionsprotein beschichtet sind, um die EB-Bindung zu erleichtern.

Ersetzen Sie das Medium durch ein inhibitorfreies Differenzierungsmedium.

Die Zellen beginnen, von den EBs nach außen zu wandern und eine 2D-Monoschicht zu bilden.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie ein Kleinhirnreifungsmedium hinzu.

Wachstumsfaktoren im Medium induzieren die Reifung neuronaler Vorläuferzellen zu unterschiedlichen zerebellären neuronalen Vorläufern.

Geben Sie am Tag Null 1 Milliliter Kleinhirndifferenzierungsmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y27632 und SB431542 in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Ultra-Low-Attachment- oder ULA-Platte, und legen Sie sie in den Inkubator, bis die angehobenen Kolonien bereit sind, in die Vertiefungen gegeben zu werden. Reinigen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 1 Milliliter iPSC-Passierlösung für jede 35-Millimeter-Schale hinzu.

Nach dreiminütiger Inkubation bei 37 Grad Celsius aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 2 Milliliter Kleinhirndifferenzierungsmedium hinzu, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y27632 und SB431542. Unter 4-facher Vergrößerung eines Durchlichtmikroskops heben Sie die Kolonien mit der gebogenen Kante der gezogenen Glaspipette an. Sobald jede Kolonie angehoben ist, übertragen Sie alle Kolonien vorsichtig mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in eine Vertiefung der 6-Well-ULA-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede iPSC-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie an Tag 2 FGF2 in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter einzustellen. Wechseln Sie an Tag 7 ein Drittel des Mediums, indem Sie 1 Milliliter verbrauchtes Medium aspirieren und durch 1 Milliliter frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium ersetzen. Inkubieren Sie die Embryoidkörper sieben Tage lang.

Schwenken Sie die Platte am 14. Tag, um alle Embryoidkörper in der Mitte der Platte zu sammeln. Kippen Sie dann die Platte und saugen Sie das gesamte verbrauchte Medium mit einer 1000-Mikroliter-Pipette vom Rand aus ab. Wenn die mittlere Menge abnimmt, legen Sie die Platte langsam flach und saugen Sie weiter, wobei Sie genügend Medium übrig lassen, um ein Austrocknen der Embryoidkörper zu vermeiden.

Fügen Sie anschließend 3 Milliliter frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium hinzu, das mit 10 Mikromolaren ergänzt wird. Y27632. Übertragen Sie dann die Embryoidkörper mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in eine mit Poly-L-Ornithin beschichtete Lamininschale. Aspirieren Sie am 15. Tag das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium.