Isolierung und Kultivierung von Zellen aus diffusen intrinsischen pontinen Gliomen

Beginnen Sie mit Hirnstammgewebefragmenten, die ein diffuses intrinsisches Ponsgliom enthalten, einen Tumor, der von glialen Vorläuferzellen in einer myelinisierten nervenreichen Umgebung abstammt.

Mit proteolytischen Enzymen behandeln, um die extrazelluläre Matrix des Gewebes abzubauen.

Pipettieren Sie den Inhalt nach der Inkubation wiederholt, um die Zelldissoziation und den Abbau der Myelinscheide zu erleichtern.

Filtrieren und zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in einem kalten Puffer

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Fügen Sie eine Saccharoselösung für die Trennung des Dichtegradienten hinzu und mischen Sie gründlich.

Als nächstes zentrifugieren Sie, um die schwereren Zellen von den leichteren Myelinresten zu trennen.

Entfernen Sie die Myelinschicht und fügen Sie einen Erythrozyten-Lysepuffer hinzu.

Fügen Sie einen kalten Puffer hinzu, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugen Sie und entfernen Sie den Überstand, um die lysierten Erythrozyten zu entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem warmen neurobasalen Medium und kultivieren Sie sie in einem unbeschichteten Kolben.

Das Fehlen neurotroper Faktoren führt zum neuronalen Tod, während die glialen Vorläuferzellen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren verwerten, was zur Proliferation führt. Fügen Sie frisches Medium hinzu, um den Wachstumsfaktorspiegel zu erhalten.

Im Laufe der Zeit aggregieren diese Zellen spontan zu Zellclustern und bilden frei schwebende Neurosphären.

Bei diesem Verfahren zentrifugieren Sie das konische Röhrchen mit den restlichen Gewebefragmenten fünf Minuten lang. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie die vorgewärmte enzymatische Aufschlusslösung hinzu, so dass auf 1 Milliliter Gewebe 5 Milliliter Aufschlusslösung kommen. Verschließen Sie dann den konischen Röhrchendeckel mit Laborfolie und inkubieren Sie die Reaktion auf einem Rotator bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Nach der Inkubation die Proben vorsichtig zerreiben. Pipettieren Sie die Probe mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette 6 bis 8 Mal auf und ab und vermeiden Sie die Bildung übermäßiger Luftblasen. Fügen Sie als Nächstes eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze an das Ende der Pipette hinzu und zerreiben Sie die Probe weitere 6 bis 8 Mal.

Lassen Sie alle verbleibenden Stücke am Boden des Rohrs absetzen. Entfernen und filtrieren Sie dann den Überstand, wobei die Zelle noch durch einen 100-Mikron-Filter suspendiert ist, in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung enzymatische Dissoziation und lagern Sie es auf Eis. Anschließend zentrifugieren Sie das enzymatische Dissoziationsröhrchen fünf Minuten lang und fahren mit der Saccharosegradientenzentrifugation fort. Wenn die Probe noch in Lösung suspendiert ist, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Gewebe in 20 Millilitern kaltem HBSS ohne Kalzium und Magnesium. Bringen Sie dann das Volumen mit kaltem HBSS auf 25 Milliliter. Fügen Sie langsam 25 Milliliter 1,8 molare Saccharoselösung hinzu und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um. Daraus ergibt sich ein Saccharosegradient von 0,9 molaren Zähnen.

Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang ohne Pause. Aspirieren Sie vorsichtig die Myelinreste und so viel Saccharoselösung wie möglich. Waschen Sie dann die Probe, indem Sie 30 Milliliter kaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzufügen und vorsichtig mischen. Danach zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang.

Entfernen Sie bei diesem Vorgang den Waschüberstand. Fügen Sie 5 Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie das Röhrchen eine Minute lang bei Raumtemperatur schwenken. Beenden Sie dann die Lyse, indem Sie 30 Milliliter kaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzufügen.

Anschließend zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang. Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in 10 bis 15 Millilitern warmem vollständigem TSM mit Wachstumsfaktoren und quantifizieren Sie die lebensfähige Zelldichte auf einem Hämozytometer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses. Anschließend wird die endgültige Zellsuspension in einen neuen T75-Kulturkolben überführt. Fügen Sie jeden zweiten Tag zusätzliche Wachstumsfaktoren hinzu, um den Gesamtwert der Wachstumsfaktoren aufrechtzuerhalten und die Entwicklung der Tumorzell-Neurosphären zu überwachen.