Isolierung und Kultivierung von zerebellären granulären Neuronen-Vorläuferzellen der Maus

Nehmen Sie das Mauswelpen Cerebella.

Homogenisieren Sie sie in kleinere Fragmente.

Fügen Sie ein proteolytisches Enzym hinzu, um die extrazelluläre Matrix des Gewebes zu verdauen und zerebelläre granuläre Vorläuferzellen (CGNPs) und Astrozyten zu lockern.

Fügen Sie CGNP-Nährmedien mit Serum hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Zentrifugieren und den enzymreichen Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Gewebefragmente in CGNP-Medien. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um die Zellen freizusetzen.

Sobald sich die Ablagerungen abgesetzt haben, überträgst du den Überstand mit den Zellen in ein frisches Röhrchen.

Zentrifugieren und den Überstand mit Schmutz entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in CGNP-Medien und säen Sie sie in Multiwell-Plattenvertiefungen, die mit Poly-D-Lysin beschichtet sind. Ausbrüten.

Astrozyten siedeln sich an der Poly-D-Lysin-Beschichtung an und haften im Vergleich zu CGNPs stark.

Die Platte schütteln und den Überstand mit CGNPs auffangen. Zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie CGNPs in CGNP-Medien und säen Sie sie auf eine mit Poly-L-Ornithin beschichtete Multiwell-Platte. Ausbrüten.

CGNPs lagern sich an die beschichtete Oberfläche und vermehren sich, unterstützt durch die Medienkomponenten und Poly-L-Ornithin.

Übertragen Sie drei bis fünf Kleinhirn in 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie das Kleinhirn vor der Zentrifugation mit HBSS-Glukose. Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um das Gewebe zu sammeln. Nach der letzten Wäsche homogenisieren Sie das Kleinhirn, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig mit einer 1-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, bis die Fragmente 0,5 bis 1 Kubikmillimeter groß sind.

Entfernen Sie vorsichtig die gesamte Flüssigkeit, bis noch 2,5 Milliliter übrig sind. Geben Sie dann 0,05 % Trypsin in das Röhrchen mit HBSS-Glukose, die die Cerebellen enthält, und inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Drehen Sie das Gewebe alle 1 bis 3 Minuten um. Nach der Inkubation stoppen Sie den Verdau, indem Sie 5 Milliliter cGMP-Zellkulturmedium oder CGM hinzufügen, und sammeln Sie das Gewebe wie zuvor durch Zentrifugation.

Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand entfernt und 1 Milliliter CGM zugegeben. Zerreiben Sie das Gewebe mit der 1-Milliliter-Pipettenspitze, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Fügen Sie dann 5 Milliliter CGM hinzu und inkubieren Sie die Mischung zwei Minuten lang auf Eis, um Gewebereste abzusetzen. Sobald sich das Gewebe abgesetzt hat, überführen Sie den Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 2 Milliliter CGM in das Restgewebe und wiederholen Sie den Verreibungsvorgang, bevor Sie den Überstand entnehmen und die Gewebereste verwerfen.

Bündeln Sie die Überstände aus jedem 15-Milliliter-Geweberöhrchen und zentrifugieren Sie, um die Kleinhirnzellen zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern CGM. Da Astrozyten schneller und stärker an Poly-D-Lysin haften als cGMPs, geben Sie bis zu 4 Milliliter Zellsuspension in die Vertiefungen von Poly-D-Lysin-beschichteten 6-Well-Platten und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Astrozyten zu entfernen.

Schütteln Sie den Teller. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie den Überstand wie zuvor. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern CGM und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. Nach 4 bis 6 Stunden erscheinen die adhärenten cGMPs rund und proliferativ. Aussäen Sie die Zellen in CGM auf Poly-L-Ornithin-beschichteten Platten und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 5 % CO₂ und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit.