Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und Differenzierung in Nervenzellen

Nehmen Sie Zellen, die aus dem Kleinhirn einer neugeborenen Maus isoliert wurden und Stammzellen, Neuronen und Gliazellen enthalten.

Fügen Sie Antikörper-beschichtete magnetische Mikrokügelchen hinzu, die an ein stammzellspezifisches Oberflächenglykoprotein binden.

Zentrifugen, entfernen Sie die ungebundenen Kügelchen und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer

Laden Sie die Zellen auf eine Trennsäule, die sich in einem Magnetseparator befindet, der die an Mikrokügelchen gebundenen Stammzellen zurückhält, während andere Zellen hindurchfließen.

Fügen Sie ein Neurosphärenmedium hinzu, um die Zellen zu eluieren und in eine Mikroplatte zu übertragen. Inkubieren, um die Bildung von primären Neurosphären, sich selbst erneuernden Kolonien von Stammzellen, zu induzieren.

Zentrifugieren und das Medium verwerfen. Resuspendieren Sie die Neurosphären in einem Medium, das Enzyme enthält, um die zellulären Adhäsionsproteine zu verdauen.

Zentrifugieren und die Enzyme entfernen. Fügen Sie das Neurosphärenmedium hinzu und dissoziieren Sie die Zellen mechanisch.

Inkubieren, um die Proliferation von Stammzellen und die Bildung sekundärer Neurosphären zu ermöglichen, während sich die differenzierten Zellen ohne Stammzelleigenschaften nicht vermehren.

Übertragen Sie die Neurosphären auf ein Differenzierungsmedium und inkubieren Sie, wodurch die Differenzierung in Neuronen und Gliazellen gefördert wird.

Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen auf Eis und seihen Sie die dissoziierten Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen ab. Bedecken Sie den Filter mit 10 Millilitern eiskalter HBSS-Lösung, um sicherzustellen, dass die Zellen durch das Netz gelangen.

Übertragen Sie die gefilterten Zellen in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 300 mal g. Verwenden Sie dann einen Vakuumsauger, um den Überstand vollständig zu entfernen.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in 160 Mikrolitern eiskaltem magnetischem Säulenpuffer. Geben Sie 40 Mikroliter Anti-Prominin-1-Mikrokügelchen in die Zellsuspension. Inkubieren Sie die Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem Kühlschrank, damit der Antikörper an die Prominin-1-exprimierenden Zellen binden kann.

Waschen Sie die Zellen mit 1 bis 2 Millilitern Säulenpuffer X und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Säulenpuffer X. Stellen Sie die magnetischen Säulen auf den Magnetständer und spülen Sie sie einmal mit 500 Mikrolitern Puffer X aus. Tragen Sie die markierte Zellsuspension auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss in frischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Puffer X. Nehmen Sie dann die Säulen aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 1 Milliliter Nährmedium hinzu und schieben Sie den Kolben in die Säule, um die mit Prominin-1-Kügelchen markierten Zellen auszuspülen.

Um die Neurosphären zu passieren, überführen Sie sie zusammen mit dem Kulturmedium in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Neurosphären werden durch Zentrifugation bei 300 mal g für 5 Minuten pelletiert und der Überstand verworfen.

Das Pellet wird in 5 Millilitern Dissoziationsmedium mit Papain oder 0,05%iger Trypsinlösung resuspendiert und die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 5 Millilitern Neurosphärenmedium und dissoziieren sie, indem Sie sie langsam 10 Mal mit einer Weidepipette auf und ab pipettieren. Plattieren Sie die Zellen mit Neurosphären-Medien, wie im Textprotokoll beschrieben, und reichern Sie sie nach 7 bis 10 Tagen in Kultur mit sekundären Neurosphären an, wie zuvor beschrieben.