JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:49 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Rattenkopfmuskel und hacken Sie ihn in Fragmente.
Fügen Sie einen Cocktail proteolytischer Enzyme hinzu und inkubieren Sie ihn unter leichtem Schütteln.
Die Enzyme verdauen die extrazelluläre Matrix des Gewebes und lockern so die Muskelfasern.
Fügen Sie Medien hinzu, die Serumproteine enthalten, um die Enzyme zu inaktivieren.
Übertragen Sie das Gewebe in ein Röhrchen, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Überstand.
Suspendieren Sie das Gewebe wieder in Medien. Wiederholen Sie den mechanischen Aufschluss und die Zentrifugation zweimal, um eine homogene Suspension von Satellitenzellen zu erhalten – Stammzellen, die für die Muskelreparatur und -regeneration entscheidend sind.
Sammeln Sie den Überstand mit der Satellitenzelle.
Durch ein Zellsieb passieren, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen im Medium resuspendieren.
Tropfen der Zellsuspension auf mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtete Kammer-Objektträgervertiefungen geben.
Die beschichtete Oberfläche erleichtert die Befestigung von Satellitenzellen. Fügen Sie den Vertiefungen Medien hinzu.
Wachstumsfaktoren in den Medien induzieren die Proliferation von Satellitenzellen und die Differenzierung in Myoblasten – Vorläufer von Muskelzellen, die sich weiter vermehren und zu mehrkernigen Myotuben fusionieren.
Die Myotuben reifen schließlich zu Muskelfasern heran.
Um die Satellitenzellen zu isolieren, übertragen Sie jeden Muskel in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte und schneiden Sie das Gewebe in kleine 2-Millimeter-Stücke, wobei Sie darauf achten, dass die Muskeln nicht zu sehr zerkleinert werden. Anschließend werden die Gewebefragmente vorsichtig in 2,5 Millilitern 0,1%iger Pronaselösung pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten inkubiert, wobei alle 20 Minuten leicht geschüttelt wird.
Wenn die Faserbündel ein gelockertes Aussehen aufweisen, geben Sie 2,5 Milliliter DMEM, ergänzt mit Pferdeserum und Antibiotika, in jede Vertiefung und übertragen Sie das verdaute Gewebe in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die Gewebeschlämme herunter und dekantieren Sie die Überstände. Geben Sie dann 5 Milliliter Medium in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie das Gewebe mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette.
Schleudern Sie das Gewebe wieder herunter und überführen Sie die Überstände in neue konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann weitere 5 Milliliter Medium in die Röhrchen und zerreiben Sie die Gewebestücke erneut, bis die Fragmente leicht durch die Pipette gelangen.
Nach einer weiteren Zentrifugation werden die Überstände in die entsprechenden Röhrchen gepoolt und die Zellsuspensionen durch 40-Mikrometer-Siebe in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen filtriert. Waschen Sie die Siebe mit 1 Milliliter DMEM, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen. Drehen Sie dann die Zellen nach unten. Resuspendieren Sie die Pellets in frischem Medium und zählen Sie die Zellen.
Um die isolierten Satellitenzellen zu kultivieren, verdünnen Sie als nächstes die Zellsuspensionen auf 1,5 x 103 Zellen pro 10 Mikroliter Kulturmedium. Geben Sie dann 10 Mikroliter Zellen auf jeden zuvor vorbereiteten extrazellulären Matrix-Gel-Spot und inkubieren Sie die Gele bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach sechs Stunden vorsichtig 400 Mikroliter Nährmedium zu jedem Gelfleck und geben Sie die Objektträger wieder in den Inkubator. Nach drei Tagen wird die Differenzierung der Zellen unter Zugabe des entsprechenden Kulturmediums eingeleitet.