Retinsäure-induzierte Neurogenese anhand embryonaler Karzinomzellen der Maus

Nehmen Sie eine embryonale Karzinom-Zellsuspension der Maus, die in der Lage ist, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren.

Samenzellen auf einer hydrophoben Kulturschale, die Medien und Retinsäure enthält.

ausbrüten. Hydrophobe Oberflächen verhindern die Zelladhäsion, wodurch die Zellen Aggregate bilden.

Retinsäure dringt in Zellaggregate ein, löst Signalwege aus und bewirkt die Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen.

Sammeln Sie nach der Inkubation die Zellaggregate.

Entsorgen Sie die Medien.

Geben Sie medien, die Retinsäure enthalten, und säen Sie die Aggregate auf eine hydrophobe Kulturschale.

ausbrüten. Retinsäure ermöglicht eine nachhaltige zelluläre Differenzierung in Neuronen.

Sammeln Sie die Aggregate, und entfernen Sie die Datenträger.

Fügen Sie ein proteolytisches Enzym hinzu, um die Zell-Zell-Adhäsionen innerhalb der Aggregate zu stören.

Fügen Sie serumhaltige Medien hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.

Dissoziieren Sie die Aggregate mechanisch und bilden eine neuronale Suspension.

Zentrifugieren und den enzymreichen Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Neuronen in Medien und säen Sie sie auf eine adhärente Multi-Well-Platte, die Medien enthält.

ausbrüten. Neuronen haften an der Platte und reifen, wobei sie lange Projektionen verlängern.

Für die Aggregatbildung beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Millilitern Differenzierungsmedium, ergänzt mit 5 Mikrolitern RA, in eine unbehandelte 100-Milliliter-Kulturschale. Säen Sie 1 Million Zellen in der Kulturschale aus und inkubieren Sie sie zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Aggregatbildung zu fördern.

Nach der Inkubation wird das Medium, das die Aggregate enthält, mit einer 10-Milliliter-Pipette abgesaugt und bei Raumtemperatur in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Warten Sie 1,5 Minuten, bis sich die Aggregate am Boden abgesetzt haben, und entsorgen Sie dann den Überstand.

Fügen Sie 10 Milliliter frisches Differenzierungsmedium hinzu, das mit 0,5 mikromolaren RA ergänzt wird. Die Zuschlagstoffe werden vorsichtig in eine neue, 100 Millimeter große, unbehandelte Kulturschale gesät und zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Verwenden Sie zunächst eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellaggregate in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Warten Sie 1,5 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich die Aggregate am Boden abgesetzt haben, und entsorgen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Aggregate mit Serum und antibiotikafreiem DMEM. Warten Sie, bis sich die Zellaggregate am Boden abgesetzt haben. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 2 Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu.

Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius und klopfen Sie alle zwei Minuten, um die Zellen in Schwebe zu halten. Fügen Sie dann 4 Milliliter Erhaltungsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und pipettieren Sie mit einer 1-Milliliter-Pipette 20 Mal auf und ab.

Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 5 Millilitern Erhaltungsmedium. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellzahl zu bestimmen, und fahren Sie mit dem Plattieren der Zellen fort. Um Zellen zu plattieren, geben Sie zunächst 3 Milliliter Erhaltungsmedium pro Vertiefung in eine Kulturplatte mit sechs Vertiefungen. Säen Sie dann die Zellen mit einer Dichte von 500.000 pro Vertiefung aus. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.