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Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:27 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie adhärente Kulturen von primären Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in einem Wachstumsmedium ein.
Geben Sie lentivirale Kontrollvektoren in die Kontrollvertiefung und Testvektoren, die Signalproteine kodieren, die die Myelinisierung regulieren, in die Testvertiefung und inkubieren Sie dann.
Die Zellen internalisieren die Vektoren, und die virale RNA wird in DNA umgekehrt transkribiert und in das Wirtsgenom eingebaut, wobei die Signalproteine in den Testzellen exprimiert werden.
Führen Sie Enzyme ein, um die OPCs vom Substrat zu lösen.
Neutralisieren Sie die Enzyme und zentrifugieren Sie, um die Enzyme zu entfernen.
Fügen Sie das Wachstumsmedium hinzu und übertragen Sie die OPCs auf Deckgläser in einer Mikroplatte mit verklebten Spinalganglion oder DRG-Neuronen. Lassen Sie die OPCs absetzen.
Füllen Sie die Vertiefungen mit dem Wachstumsmedium und inkubieren Sie. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen löst die OPC-Reifung zu Oligodendrozyten aus.
Die exprimierten Signalproteine veranlassen Oligodendrozyten, Myelinscheiden um die DRG-Neuronen zu bilden.
Beurteilen Sie die durch Signalproteine induzierte Myelinscheidenbildung in den Testzellen im Vergleich zu den Kontrollvektor-transduzierten Zellen.
Für dieses Protokoll werden primäre Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs, in 10-Zentimeter-Platten mit 10 Millilitern SATO-Medien kultiviert, die die folgenden Wachstumsfaktoren enthalten: CNTF, PDGF, NT3 und Forskolin. Die Zellen müssen 24 Stunden lang unter 8 % Kohlendioxid kultiviert worden sein.
Beginnen Sie mit dem Ansaugen des Mediums und entfernen Sie es vollständig. Ersetzen Sie es dann durch 10 Milliliter des gleichen Mediums mit den Wachstumsfaktoren. Infizieren Sie Ihre OPCs mit Lentiviren und exprimieren Sie das Protein von Interesse, indem Sie das erforderliche Virusvolumen tropfenweise in das Medium geben.
Mischen Sie außerdem in einer separaten OPC-Platte das Kontroll-Lentivirus, das nur GFP exprimiert, in das Medium. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden und sammeln Sie dann die OPCs von den Platten, um sie auf die kultivierten DRG-Neuronen auszusäen.
Spülen Sie zunächst jede Platte zweimal mit 8 Millilitern EBSS aus. 1 Milliliter Trypsin-EDTA 0,05% mit 9 Millilitern warmem EBSS bilden. Geben Sie 5 Milliliter des verdünnten Trypsins auf jede Platte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für bis zu zwei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 5 Milliliter 30% FBS in EBSS hinzufügen.
Waschen Sie dann mit einer 10-Milliliter-Pipette die OPCs von der Oberfläche der Platte. Drehen Sie die Platte jedes Mal um eine Vierteldrehung, um alle Zellen zu sammeln. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 180 g zentrifugiert.
Aspirieren Sie nun den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter warmem SATO-Medium ohne Wachstumsfaktoren und zählen Sie die Zellen. Bereiten Sie als Nächstes die DRG-Neuronen vor, die auf den 22-Millimeter-Deckgläsern kultiviert werden, indem Sie das Medium vollständig von ihrer Platte absaugen.
Säen Sie dann vorsichtig 200.000 OPCs tropfenweise auf jedes Deckglas aus. Das Saatvolumen muss weniger als 200 Mikroliter pro Deckglas betragen. Lassen Sie die Zellen sich absetzen, ohne die Platte zu bewegen. Nach 10 Minuten jede Vertiefung mit einem Milliliter warmem SATO Medium auffüllen. Beschichten Sie nun die verbleibenden Schwester-OPCs mit SATO-Medien, die Wachstumsfaktoren enthalten. Sie können später verwendet werden, um die Expression des interessierenden Proteins zu überprüfen.