Isolierung von schädelförmigen Nervenfalten aus einem Kükenembryo für eine Zellkultur der Neuralleiste

Nehmen Sie einen Hühnerembryo, der in einem Filterpapierrahmen gelagert ist, und positionieren Sie ihn unter einem Präpariermikroskop.

Entfernen Sie die Vitellinmembran, eine Schutzschicht, die den Embryo umgibt.

Identifizieren Sie die Neuralfalten des Mittelhirns, die sich hinter den Sehlappen und vor der Herzsichel, dem embryonalen Vorläufer des reifen Herzens, befinden.

Die Neuralfalten enthalten prämigratorische Neuralleistenzellen, bei denen es sich um multipotente Stammzellen handelt, die sich während der Entwicklung in wandernde Zellen verwandeln.

Diese wandernden Zellen differenzieren sich in neuronale und nicht-neuronale Zellen.

Schneiden Sie den dorsalsten Aspekt der Neuralfalten heraus und geben Sie das Gewebe in eine Kulturschale mit Puffer.

Legen Sie anschließend Deckgläser, die mit einem Adhäsionsprotein beschichtet sind, in Kulturplattenvertiefungen, die Medien enthalten.

Übertragen Sie die Neuralfalten auf die beschichteten Deckgläser. Inkubieren, um die Gewebebefestigung zu erleichtern.

Während der Kultivierung treten wandernde Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten auf die beschichtete Oberfläche auf, wodurch sich eine Neuralleisten-Zellkultur bildet.

Übertragen Sie einen Embryo in eine saubere Schüssel, die Ringer's Pen-Strep Lösung enthält. Schwenken Sie den Embryo vorsichtig hin und her, um jegliches Eigelb zu entfernen, das die Sicht verdeckt, und tauschen Sie die Ringer's Pen-Streptokokken-Lösung aus oder geben Sie sie in eine frische Schüssel, wenn sie trüb wird. Positionieren Sie den Embryo dorsal und mit der Rahmenseite nach oben unter einem Präpariermikroskop. Lassen Sie den Embryo auf dem Papierrahmen, um ihn gedehnt und an Ort und Stelle zu halten.

Entfernen Sie dann die Vitellinmembran mit einer Pinzette, um die Neuralfalten freizulegen. Umfassen Sie das Gewebe kaudal zu den expandierenden optischen Vesikeln und rostral zum Hinterhirn, wo Rhombomerverengungen gerade erst auftreten. Schneiden Sie mit einer Federschere vorsichtig die Neuralfalten des Mittelhirns heraus. Achten Sie darauf, dass der dorsnahe Aspekt der Neuralfalte mit minimaler Kontamination des Neuralrohrs und des nicht-neuralen Ektoderms herausgeschnitten wird, und übertragen Sie die Neuralfalten mit einem P20-Pipettier oder einer sterilen Pasteur-Glaspipette, die mit dotteriger Ringer's Pen-Streptokokken-Lösung gespült wurde, in eine saubere Schale mit Ringer's Pen-Strepto-Lösung.

Bewahren Sie gesammelte Falten auf Eis auf, während Sie weitere Falten zerlegen. Nachdem Sie die Kulturschale aus dem Inkubator genommen haben, verwenden Sie eine Pipette oder eine Pasteurpipette, um die Fibronektinlösung aus der Deckglasschale oder der Vertiefung zu entfernen. Nachdem Sie das mit Fibronektin beschichtete Substrat mit Ringer's Pen-Strep Lösung gespült haben, geben Sie eine angemessene Menge des vollständigen Nährmediums in die Schale oder Vertiefung.

Um den Kunststoff zu blockieren und ein Ankleben des Gewebes zu verhindern, verwenden Sie eine P20- oder P200-Pipette und spülen Sie die Pipettenspitze mit dotteriger Ringer's Pen-Strep Lösung ab. Übertragen Sie dann die isolierten Neuralfalten in die Mitte des mit Fibronektin beschichteten Deckglases und achten Sie darauf, so wenig Ringer-Pen-Streptokokken-Lösung wie möglich zu übertragen. Nachdem Sie die Explantate 10 bis 15 Minuten lang ruhen gelassen haben, legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 38 Grad Celsius, indem Sie die Kulturschale mit plattierten Neuralfalten langsam und vorsichtig tragen.