Isolierung von Neuronen vestibulärer Ganglien aus dem Innenohr einer Maus

Nehmen Sie die Hälfte des Kopfes eines Mäusewelpen und entfernen Sie das Gehirn.

Schneiden Sie die Oberseite des Schädels ab und schneiden Sie das umgebende Gewebe heraus, um die otische Kapsel sichtbar zu machen, eine knöcherne äußere Schicht, die die Innenohrstrukturen schützt.

Übertragen Sie das Gewebe auf eine Kulturplatte, die ein gepuffertes Medium enthält.

Trennen Sie die oberen und unteren Vestibularganglien, die die vestibulären Nervenzellkörper enthalten.

Rasieren Sie den knöchernen Kamm ab und entnehmen Sie das darunter liegende Ganglion superior.

Das Ganglion superior wird auf eine frische Platte mit dem gepufferten Medium übertragen.

Entfernen Sie anhaftendes Gewebe von der Oberfläche, um das isolierte Ganglion zu reinigen.

Lege das Ganglion in eine Lösung, die proteolytische Enzyme enthält.

Die Enzyme bauen die extrazelluläre Matrix des Gewebes ab und lockern die Zellen auf.

Übertragen Sie das Ganglion in eine polymerbeschichtete Glasbodenschale, die Kulturmedium enthält, und dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um die Zellen freizusetzen.

Inkubieren, damit die Zellen adhäsieren und eine vestibuläre Ganglien-Neuronenkultur etablieren können.

Schöpfen Sie das Gehirn der eingeschläferten Maus mit einer geschlossenen chirurgischen Schere heraus. Durchtrennen und entfernen Sie den Hirnnerv, um das Gehirn vollständig vom Schädel zu lösen. Beginnen Sie am Hinterkopf, ziehen Sie das durchsichtige membranöse Material mit einer Pinzette ab und schneiden Sie dann die Oberseite des Schädels mit einer chirurgischen Schere heraus.

Entfernen Sie das überschüssige Gewebe am Hinterkopf und am Hals, um den Präparierbereich und die Kapsel sauberer und leichter zugänglich zu machen. Übertragen Sie das Gewebe in eine zweite Petrischale mit frischer L-15-Lösung. Lokalisieren Sie dann die Kapsel oticus und den Nervus auditorialis, den Nervus vestibuläris superior und den Nervus vestibularis inferior. Trennen Sie die Ganglien superior und inferior mit einer kleinen Federschere und schneiden Sie den Hörnerv ab.

Rasieren Sie mit einem Skalpell den knöchernen Kamm vorsichtig ab, um den knöchernen Bereich zu schwächen, unter dem der Nerv in die knöcherne Kapsel eintaucht. Entfernen Sie die Ablagerungen vorsichtig mit einem Skalpell und legen Sie den gesamten geschwollenen Teil des Ganglion frei.

Schneide und trenne mit der feinen Federschere das Ganglion vom peripheren Nervenast, der in Richtung Utricula abtaucht. Entfernen Sie das obere Ganglion mit einer feinen Pinzette und geben Sie es in eine 35-Millimeter-Petrischale mit frischer L-15-Lösung.

Nachdem Sie die Enzymlösung vorgewärmt haben, gießen Sie die Enzymmischung in eine 35-Millimeter-Petrischale und stellen Sie sie für 10 bis 15 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Reinigen Sie das Ganglion mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Federschere, indem Sie Knochen, überschüssiges Gewebe, Nervenfasern und andere überflüssige Strukturen entfernen. Achten Sie darauf, die Entfernung von Gangliengewebe zu minimieren.

Übertragen Sie die gereinigten Ganglien in die vorgewärmte Enzymlösung und legen Sie sie für 10 bis 40 Minuten wieder in den Inkubator. Übertragen Sie dann die Ganglien mit frischer L-15-Lösung in die 35-Millimeter-Petrischale.

Nach zwei bis drei Minuten überführen Sie die Ganglien in eine weitere 35-Millimeter-Petrischale, die mit gefiltertem Nährmedium gefüllt ist. Füllen Sie ca. 150 Mikroliter gefiltertes Nährmedium in eine beschichtete Glasbodenschale. Übertragen Sie dann die gewünschte Anzahl an Ganglien auf das Deckglas.

Ziehen Sie eine kleine Menge Nährmedium aus der Kulturschale und spülen Sie die Verreibpipette mit Medium ab, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Seiten der Glaspipette kleben bleibt. Zerreiben Sie, indem Sie das Gewebe vorsichtig und wiederholt durch die Pipette führen, bis die Ganglien ausreichend dissoziiert sind.

Überprüfen Sie nach fünf Minuten unter einem Lichtmikroskop, ob sich die Zellen auf dem Deckglas abgesetzt haben. Stellen Sie eine Kulturschale vorsichtig für 12 bis 24 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.