Isolierung und Kultivierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirnkortex von Maus-Welpen

0 Ansichten4:39 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie den Kortex eines Mauswelpen.

Fügen Sie ein proteolytisches Enzym hinzu, das die extrazelluläre Matrix des Gewebes verdaut. Dissoziieren Sie dann das Gewebe mechanisch und lockern die Zellen.

Fügen Sie Gliamedien und DNase hinzu, um kontaminierende DNA abzubauen.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um Neuronen und Gliazellen freizusetzen.

Sobald sich das unverdaute Gewebe abgesetzt hat, sammeln Sie das Medium mit den Zellen und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in Gliamedien und plattieren Sie sie auf einem mit extrazellulären Matrixproteinen beschichteten Kolben.

ausbrüten. Astrozyten haften stärker an der beschichteten Oberfläche als andere Zellen. Gliamedien fördern nur das Überleben der Gliazellen.

Tauschen Sie das Medium aus, um Schmutz zu entfernen.

Inkubieren Sie durch Schütteln, um die darüber liegenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs und Mikroglia abzulösen.

Übertragen Sie das Medium mit den Zellen auf eine Kulturplatte.

Inkubieren Sie durch Schütteln, um die differentielle Adhäsion der Mikroglia zu erleichtern.

Übertragen Sie den nicht adhärenten OPC-Überstand auf eine Poly-D-Lysin-beschichtete Multiwell-Platte. Inkubieren für OPC-Adhärenz.

Ersetzen Sie die Medien durch OPC-Medien, um OPC-Wachstum zu ermöglichen.

Geben Sie 1 Milliliter 0,05 % Trypsin mit 0,53 millimolaren EDTA in jedes Röhrchen mit dem Gewebe. Zerreiben Sie die Mischung mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 20 Mal. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein leeres konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und rühren Sie die Lysate nach acht Minuten vorsichtig um. Geben Sie nach der Inkubation 5 Milliliter MGM und 200 Mikroliter DNase-I in jedes Röhrchen, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Trituieren Sie jedes Lysat 10 Mal mit einer 10-Milliliter-Pipette.

Lassen Sie die Zellsuspension dann drei Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen, damit sich nicht dissoziiertes Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen kann. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen, wobei das nicht dissoziierte Gewebe zurückbleibt. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in 5 Millilitern MGM resuspendieren und 20-mal zerreiben.

Plattieren Sie die Zellsuspensionen auf beschichteten T-25-Kolben und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um die Isolierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durchzuführen, schütteln Sie die Zellen 15 Stunden lang. Nehmen Sie dann den Überstand aus dem Kolben und geben Sie ihn auf eine sterile Petrischale.

Inkubieren Sie den Überstand 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und schwenken Sie ihn nach 15 Minuten, um die verbleibenden Mikroglia zu entfernen. Entfernen Sie den nicht adhärenten Zellüberstand. Zählen Sie die Zellen und plattieren Sie sie auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche in der gewünschten Konzentration.

Bringen Sie die Zellen für mindestens eine Stunde in den Inkubator zurück. Saugen Sie dann vorsichtig 95 % des Mediums an und fügen Sie langsam warmes OPC-Medium hinzu, indem Sie es gegen die Wand des Wells pipettieren, um die Störung der OPCs zu minimieren.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026