Isolierung und Kultur von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem Mausembryo

Nehmen Sie eine transgene schwangere Maus und entfernen Sie chirurgisch die Gebärmutter mit Embryonen, die fluoreszenzmarkierte Motoneuronen enthalten.

Übertragen Sie die Gebärmutter in eine Schale mit einem eiskalten Puffer unter einem Fluoreszenzmikroskop

Verwenden Sie sichtbares Licht, um die Embryonen zu isolieren.

Entfernen Sie das Gesicht und den Schwanz der Embryonen und richten Sie sie in Bauchlage aus.

Machen Sie mit Hilfe des Fluoreszenzsignals einen Schnitt im Mittelhirn, um die okulomotorischen und trochleären Kerne freizulegen, die Motoneuronen enthalten.

Isolieren Sie das Mittelhirn, das die Zellkerne enthält.

Öffnen Sie die dorsale Seite des Hinterhirns und des Rückenmarks. Isolieren Sie das Rückenmark, entfernen Sie beide Enden und sammeln Sie die Säulen mit den spinalen Motoneuronen.

Behandeln Sie das gesammelte Gewebe mit Enzymen, um die Gewebematrix zu dissoziieren. Ernten Sie die einzelnen Zellen und isolieren Sie fluoreszenzmarkierte Neuronen mit FACS.

Geben Sie ein Kulturmedium zu den isolierten Neuronen, übertragen Sie die Zellen auf eine mit Kultursubstrat beschichtete Mikroplatte und inkubieren Sie, damit die Zellen anhaften und wachsen können.

Pflegen Sie die Motoneuronen in Kultur.

Beginnen Sie mit der Entnahme von Islet-1 EGF-positiven Embryonen von einer trächtigen Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung. Sprühen Sie den Bauch gründlich mit Ethanol ein und entfernen Sie die Gebärmutter mit einer sterilen Mikrodissektionsschere und einer Daumenverbandezange. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in sterilem PBS. Übertragen Sie es dann auf die mit vorgekühltem sterilem PBS gefüllte Sezierplatte.

Entnehmen Sie unter dem hellen Licht des Mikroskops vorsichtig die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Mikrodissektionschere, einer Daumenverbandezange und einer Dumont-Pinzette Nummer 5. Verwenden Sie dann einen sterilen Moria-Mini-perforierten Löffel, um jeden Embryo in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte zu übertragen, die mit vorgekühltem Hibernate E Medium mit niedriger Fluoreszenz gefüllt ist, das mit 1X V27 ergänzt wird.

Während Sie die Platte auf Eis halten, übertragen Sie einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte und bedecken Sie sie vollständig mit eiskalter, steriler Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gesicht des Embryos und den Schwanz zu entfernen, ohne das Mittelhirn zu beschädigen. Platzieren Sie dann den Embryo in Bauchlage, wobei die Gliedmaßen gespreizt sind und der Schwanz zur Vorderseite des Mikroskops zeigt.

Schlitzen Sie mit einer Pinzette das Dach des vierten Ventrikels auf, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Nutze diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Präparieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryos rostral zur Rinde und lateral zur Bodenplatte und zur motorischen Säule.

Öffnen Sie dann das präparierte Gewebe in einer Open-Book-Manier, um die GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne freizulegen. Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie Hirnhautgewebe mit einer Pinzette und einem Mikrodissektionsmesser.

Präparieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne von der Bodenplatte und anderem GFP-positiven umgebenden Gewebe und achten Sie darauf, die Neuronen nicht zu berühren oder zu beschädigen. Wenn Sie separate CN3- und CN4-Kerne sammeln, schneiden Sie entlang des Mittelhirns dieser beiden Kerne und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das präparierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS zu sammeln.

Geben Sie es in ein beschriftetes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Seziermedium gefüllt ist. Lagern Sie das Röhrchen bis zur Dissoziation auf Eis. Fahren Sie fort, ventrale Mittelhirne von weiteren Embryonen im selben Röhrchen zu poolen, bis die Gesamtzahl den experimentellen Anforderungen entspricht.

Um das ventrale Rückenmark zu präparieren, halten Sie den Embryo mit dem Kopf zur Vorderseite des Mikroskops liegend. Halten Sie sie mit einer Pinzette fest und führen Sie die Spitze des anderen Paares in den ungeöffneten kaudalen Teil des vierten Ventrikels ein. Der Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks wird dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos geöffnet. Schneiden Sie das dorsale Gewebe beginnend mit dem vierten Ventrikel in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks, indem Sie die Pinzette als Schere verwenden.

Halten Sie dann den Embryo mit einer Pinzette fest und kneifen Sie den Lappen des Rückengewebes auf jeder Seite mit dem anderen Paar ab. Entfernen Sie das ventrale Rückenmark, indem Sie mit dem Mikrodissektionsmesser direkt unter das GFP-positive SMN stechen und das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten anheben.

Schneiden Sie das Rückenmark quer an der oberen Grenze der unteren Extremität ab und entfernen Sie den zervikalen Lendenbereich. Querschnitt direkt über C1, wo das erste GFP-positive Vorderhorn hervorragt. Legen Sie das ventrale Rückenmark mit der dorsalen Seite nach oben und halten Sie es fest, indem Sie das GFP-negative Gewebe mit einer Pinzette zwischen die GFP-positiven SMN-Säulen drücken.

Entfernen Sie das verbleibende anhaftende Mesenchym, die DRGs und das dorsale Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser abschneiden. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das präparierte ventrale Rückenmarksgewebe mit minimalem HBSS zu entnehmen, und legen Sie es in ein markiertes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Dissektionsmedium gefüllt ist. Lagern Sie es bis zur Dissoziation auf Eis und fahren Sie mit der Bündelung des ventralen Rückenmarks von weiteren Embryonen in derselben Röhre fort.

Geben Sie das entsprechende Volumen Papainlösung in jedes der Mikrozentrifugenröhrchen mit den präparierten Gewebeproben. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und rühren Sie die Röhrchen alle 10 Minuten durch Fingerschnippen.

Nach der Inkubation jede Suspension achtmal vorsichtig mit einer P200-Pipette verreiben. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 mal g. Resuspendieren Sie die Zellpellets mit der entsprechenden Menge Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand mit einer P1000-Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen in dem entsprechenden Volumen des Dissektionsmediums. Filtern Sie die Suspensionen durch 70-Mikrometer-Zellsiebe.

Verwenden Sie als Nächstes die FACS-Sortierung, um GFP-positive Zellen zu isolieren, die aus CN3, CN4 und SMN seziert wurden. Verdünnen Sie die isolierten Zellsuspensionen mit Motoneuronen-Kulturmedium, das auf 37 Grad Celsius auf die entsprechende Dichte vorgewärmt wurde, und geben Sie 200 Mikroliter der Suspension in eine Vertiefung einer PDL-Laminin-beschichteten 96-Well-Platte. Kultivieren Sie die Neuronen in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und achten Sie darauf, das Kulturmedium der Motoneuronen alle fünf Tage zu erneuern.