Differenzierung humaner neuraler Stammzellen in neurale und Astrozyten-Vorläuferzellen

Beginnen wir mit nicht-adhärenten Neurosphären, einem dreidimensionalen Aggregat menschlicher neuraler Stammzellen in einem aus Zellkulturen gewonnenen konditionierten Medium.

Dieses Medium enthält Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixkomponenten, die die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhalten.

Zentrifuge, um die Neurosphären zu sammeln.

Behandeln Sie sie mit Trypsin- und DNase-Enzymen, mischen Sie den Inhalt und inkubieren Sie sie.

Trypsin stört die Zell-zu-Zell-Adhäsion und erleichtert die Zellablösung, während DNase freie DNA abbaut, um Zellverklumpungen zu verhindern.

Pipettieren Sie den Inhalt wiederholt, um eine einzellige Suspension zu bilden. Fügen Sie dann einen Trypsin-Inhibitor hinzu, um die Enzymaktivität zu neutralisieren.

Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen dann in einem Proliferationsmedium, das neuronale Wachstumsfaktoren enthält.

Die Zellsuspension auf ein polymerbeschichtetes Deckglas säen, das in einer Multiwell-Platte platziert ist. Inkubieren, um die Anheftung der Stammzellen an das Polymer zu ermöglichen.

Darüber hinaus differenzieren sich die Stammzellen auf der Grundlage der Absorption spezifischer Wachstumsfaktoren in neurale und Astrozyten-Vorläuferzellen, die für die weitere Reifung zu spezialisierten Zelltypen bereit sind.

Nach der Vorbereitung des Kulturmediums und der Beschichtung menschlicher neuraler Stammzellen gemäß dem Textprotokoll ist der Kolben mit den zu passagenden Zellen aus dem Inkubator zu entnehmen und in die Biosicherheitswerkbank oder BSC zu bringen. Kippen Sie den Kolben vorsichtig, so dass die Zellen auf den Boden des gepoolten Mediums sinken können.

Füllen Sie 10 Milliliter des Mediums in zwei 5-Milliliter-Portionen in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung "CM" für ein konditioniertes Medium. Es ist darauf zu achten, dass keine der im Kolben abgelagerten Zellen aspiriert werden. Übertragen Sie 3 Milliliter Medium aus dem CM-Röhrchen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung "Trypsin-Inhibitor-Lösung". Legen Sie dann die CM-Röhre beiseite.

Entfernen Sie dann die 5 Milliliter des Mediums und der Zellen, die im T75-Kolben verbleiben, und geben Sie ihn in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift "Zellen". Spülen Sie dann mit einer serologischen Pipette und einem Volumen von 3,5 Millilitern des CM den T75-Kolben zweimal und überführen Sie die CM-Spülung in das Röhrchen mit den Zellen. Dadurch werden alle Neurosphären aus dem T75-Kolben entfernt.

Das Röhrchen "Zellen" wird bei 100 mal g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert. Während sich die Zellen drehen, holen Sie sich die zuvor vorbereitete DPBS-Glukoselösung aus dem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und fügen Sie die entsprechende Menge Trypsin und DNase hinzu.

Nachdem sich das "Zellen"-Röhrchen nicht mehr dreht, entfernen Sie den gesamten konditionierten Medienüberstand und übertragen Sie ihn in das CM-Röhrchen. Geben Sie Trypsinlösung zum Zellpellet im 15-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie mit einer 5-Milliliter-Pipette etwa 5 bis 10 Mal auf und ab. Schließen Sie die Kappe des Röhrchens und inkubieren Sie es fünf Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad.

Geben Sie in das Trypsin-Hemmer-Röhrchen das entsprechende Volumen des Trypsin-Inhibitors und fügen Sie das gleiche Volumen der Lösung hinzu, das für die Trypsin-Lösung verwendet wurde. Geben Sie dann die Trypsin-Inhibitor-Lösung bis zur Verwendung in das 37 Grad Celsius heiße Wasserbad.

Pipettieren Sie die Zellen nach der Inkubation 5 bis 10 Mal auf und ab. Inkubieren Sie die Probe dann weitere 10 bis 15 Minuten im 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Nach der Zellinkubation pipettieren Sie die Zellen auf und ab, bis die Kügelchen vollständig dissoziiert sind. Fügen Sie dann sofort die Trypsin-Inhibitor-Lösung hinzu und pipettieren Sie die Zellsuspension 10 Mal auf und ab.

Um die Anzahl der Zellen in der Suspension zu zählen, pipettieren Sie 15 Mikroliter Trypanblau-Vormischung auf ein kleines Wägeschiffchen und fügen Sie 5 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Pipettieren Sie zum Mischen 3 bis 5 Mal auf und ab. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter der Trypanblau-Zellsuspension auf eine der beiden Seiten eines Hämozytometers, das mit einem Glasdeckglas bedeckt ist.

Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jedem der vier Eckgitter. Addieren Sie dann diese Zahlen. Nach Berechnung der Anzahl der Zellen gemäß dem Textprotokoll wird jedem T75-Kolben ein Volumen Zellsuspension zugesetzt, um 5 x 10⁶ Zellen pro Kolben zu erhalten.

Wenn das Volumen weniger als 5 Milliliter beträgt, fügen Sie zusätzliches konditioniertes Medium bis zu 5 Milliliter hinzu. Anschließend werden 10 Milliliter neues DFHGFPS-Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, in den Kolben gegeben. Stellen Sie sicher, dass der Kolben mit dem Zelltyp, dem Datum, der Anzahl der Zellen im Kolben und der Durchgangsnummer beschriftet ist. Falls gewünscht, inkubieren Sie die Zellen an dieser Stelle.

Um adhärente HNSCs zu plättieren, reinigen Sie die BSC am Tag vor der Übergabe wie im Textprotokoll beschrieben und verwenden Sie eine Pinzette, um einzelne sterile 12-Millimeter-Glasdeckgläser in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu platzieren. Beschichten Sie die Vertiefungen mit Deckgläsern mit 250 Mikrolitern 0,01 % Poly-D-Lysin oder PDL in sterilem Wasser und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das PDL aus den Vertiefungen und beschichten Sie sie dann mit 1 Mikrogramm Laminin DPBS.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Wenn Sie am nächsten Tag nicht benötigt werden, wickeln Sie Parafilm um die Ränder der Platte, um ihn zu versiegeln, und lagern Sie ihn bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie überschüssige Lamininlösung durch Aspiration aus den Vertiefungen und verwenden Sie 0,5 Milliliter DPBS, um die Vertiefungen einmal zu spülen. Dann säen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einer Dichte von 0,6 bis 1 x 10⁵ Zellen pro Quadratzentimeter aus.