Generierung von zerebralen Organoiden vom Vorderhirntyp aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Beginnen Sie mit einer Vertiefungsplatte mit geringer Bindung, die humaninduzierte pluripotente Stammzellen oder iPSCs in einem Stammzellmedium enthält, das mit einem Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt wird.

Die Inhibitoren dringen in die Zellen ein, blockieren die Rho-Kinase-Enzyme und halten die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht. Dies fördert die Bildung von iPS-Aggregaten.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Stammzellmedium, damit die Aggregate wachsen können. Übertragen Sie sie in eine Kulturschale mit geringer Anhaftung und einem kortikalen Induktionsmedium.

Die Bestandteile dieses Mediums bewirken, dass sich die iPSCs in neuroektodermale Zellen, eine neuronale Vorstufe, differenzieren.

Übertragen Sie jedes neuroektodermale Aggregat auf eine Folie mit flachen Vertiefungen.

Ersetzen Sie das Medium durch eine Basalmembranmatrix und inkubieren Sie, um die Matrixverfestigung und den Einschluss von Aggregaten zu ermöglichen.

Diese in die Matrix eingebetteten Aggregate werden in eine Schale mit einem kortikalen Induktionsmedium überführt und unter Rühren inkubiert.

Im Laufe der Zeit nutzen die neuroektodermalen Zellen die Differenzierungsfaktoren und entwickeln sich zu Neuroepithelzellen.

Wechseln Sie das Medium zu einem organoiden Differenzierungsmedium, das es den Zellen ermöglicht, zu spezialisierteren Zelltypen zu reifen und ein zerebrales Organoid zu bilden, das der Vorderhirnrinde ähnelt.

Um pluripotente Stammzellaggregate zu erzeugen, geben Sie bei einer Konfluenz der Stammzellkulturen von 70 % bis 90 % 500 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz in eine Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte, um die Zellen abzulösen.

Induzierte pluripotente Stammzellen, die an Monolayer-Kulturbedingungen angepasst sind, sind ein guter Zelltyp zur Erzeugung von Aggregaten, da sie während des Dissoziations- und Aggregationsverfahrens weniger anfällig für stressinduzierten Zelltod sind.

Klopfen Sie nach 5 bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius vorsichtig auf die Platte und verwenden Sie 2 Milliliter DMEM/F-12, um die Zellen vom Boden der Vertiefung zu waschen. Die resultierende Zellsuspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und das Volumen der Zelllösung mit mehr DMEM/F-12-Medium auf 10 Milliliter erhöht.

Nach der Zählung werden 4,5 mal 10 Zellen pro pluripotentem Stammzellaggregat in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation entnommen. Resuspendieren Sie das Pellet in dem entsprechenden Volumen an pluripotentem Stammzellmedium, ergänzt mit 50 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, um eine mittlere Konzentration von 4,5 x 10³ Zellen pro 150 Mikroliter zu erreichen.

Geben Sie als Nächstes 150 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte mit geringer Bindung und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator. Zur Überwachung der Induktion des anterioren Neuroektoderms verwenden Sie ein Gewebekulturmikroskop, um die morphologischen Veränderungen der pluripotenten Stammzellaggregate jeden Tag bei geringer Vergrößerung genau zu beobachten.

An Tag 1 sollten Zellaggregate mit klaren Grenzen beobachtet werden. Aspirieren Sie an Tag 2 vorsichtig etwa 2/3 des Mediums, ohne die Zellaggregate am Boden jeder Vertiefung zu stören, und ersetzen Sie das verworfene Medium durch 100 Mikroliter frisches pluripotentes Stammzellmedium.

Zwischen vier und sechs Tagen später, wenn die Zellaggregate einen Durchmesser von 350 bis 450 Mikrometern erreichen und glatte Kanten aufweisen, verwenden Sie eine modifizierte 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um bis zu 20 Aggregate in eine einzelne 6 Zentimeter große Kulturplatte mit niedrigem Anhaftungsvermögen zu übertragen, die 5 Milliliter kortikales Induktionsmedium enthält.

Ersetzen Sie das kortikale Induktionsmedium alle drei Tage durch frisches Medium und überwachen Sie die Morphologie der Aggregate täglich unter dem 4x-Ziel. Nach vier bis fünf Tagen im kortikalen Induktionsmedium sollten die Ränder der Zellaggregate an der Oberfläche aufzuhellen beginnen, was auf eine neuroektodermale Differenzierung hinweist, und die radiale Organisation eines pseudostratifizierten Epithels sollte hervortreten.

Um die neuroektodermalen Aggregate in ein Matrixgerüst einzubetten, füllen Sie einen Basalmembranextrakt für zwei bis drei Stunden auf Eis. Während der Extrakt auftaut, schneiden Sie die Paraffinfolie mit einer sterilen Schere in ein 4 x 4 Zentimeter großes Quadrat pro 16 Organoide und legen Sie jedes Stück Folie auf eine leere 100-Mikroliter-Mikropipettenspitze.

Drücken Sie die Paraffinfolie mit einer behandschuhten Fingerspitze, so dass kleine Grübchen entstehen, und reinigen Sie die Folie mit 70 % Ethanol. Nach einer 30-minütigen UV-Bestrahlung in einer geschlossenen, sterilen Biosicherheitswerkbank können Sie mit einer modifizierten 100-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Öffnung von 1 1/2 bis 2 Millimetern jedes Zellaggregat in ein Grübchen im Film übertragen.

Wenn alle Aggregate übertragen wurden, verwenden Sie eine ungeschnittene 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Medium vorsichtig aus jedem Grübchen abzusaugen, und fügen Sie 40 Mikroliter unverdünnten Basalmembranextrakt zu jedem Zellaggregat hinzu.

Achten Sie darauf, die Organoide nicht durch grobe Manipulation oder Aspiration in die Pipettenspitze zu beschädigen, da dies das sich entwickelnde Neuroepithel schädigt.

Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Aggregate in der Mitte jedes Tropfens zu positionieren, und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Paraffinfilmplatte vorsichtig in eine 10 Zentimeter große Petrischale zu überführen. Stellen Sie die Schale für 15 bis 20 Minuten in den Inkubator.

Während sich der Extrakt verfestigt, geben Sie 5 Milliliter frisches kortikales Induktionsmedium in eine sechs Zentimeter große Kulturschale mit niedrigem Attachment. Drehen Sie am Ende der Inkubation das Paraffinfolienblatt um und drücken Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig bis zu 16 polymerisierte Tröpfchen in jede 6-Zentimeter-Schale. Geben Sie dann die Aggregate wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück.

Am nächsten Tag werden die Organoid-Kulturschalen in einem Zellkultur-Inkubator in einem Zellkultur-Inkubator mit täglicher Lichtmikroskopie auf einen schaukelnden Zellkulturschüttler umgeladen, der in einem 5-Grad-Winkel mit 14 U/min geneigt ist, bis die Aggregate die gewünschte Differenzierungsphase erreichen.