Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria einer Maus

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Neurowissenschaften

0 Ansichten • 4:52 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie ein Dünndarmsegment der Maus, das zuvor von den Längsmuskeln und dem Plexus myentericus, von Schichten, die enterische Neuronen enthalten, und von Gliazellen befreit wurde.

Schneiden Sie das Gewebe auf und legen Sie es in einen EDTA-haltigen Puffer. Inkubieren Sie mit Schaukeln.

EDTA stört Zell-Zell-Verbindungen und löst die Epithelschleimhaut von den darunter liegenden Lamina propria und Submukosa, Bindegewebsschichten, die enterische Gliazellen enthalten.

Pipettieren Sie wiederholt, um die Epithelzellen zu entfernen.

Filtrieren Sie durch ein Zellsieb und entsorgen Sie den Durchfluss.

Übertragen Sie das Gewebe in einen nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer und inkubieren Sie es unter Schaukeln. Der Dissoziationspuffer lockert die Lamina propria und die submuköse extrazelluläre Matrix und löst die Zellen ab.

Pipettieren Sie wiederholt, um die Zellen weiter zu dissoziieren.

Filtrieren Sie durch ein Zellsieb, um die Zellen zu sammeln.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem Puffer.

Nehmen Sie mit Adhäsionsproteinen beschichtete Vertiefungen, die ein gliales Wachstumsmedium enthalten, und plattieren Sie die Zellen.

Die Beschichtung erleichtert die Zelladhäsion, während die Wachstumsfaktoren selektiv die Proliferation von Gliazellen fördern und eine Lamina propria und eine submuköse Gliazellkultur etablieren.

Um die Epithelschleimhaut zu entfernen, schneidet man zunächst mit einer feinen Schere den Darm in etwa 0,5 Zentimeter große Stücke und sammelt die Stücke in 30 Millilitern eiskalter EDTA/HEPES/DPBS-Lösung. Schütteln Sie die gewebehaltige Lösung 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei etwa 60 Neigungen pro Minute.

Befeuchten Sie eine 5-Milliliter-Kunststoffpipette vor, indem Sie den EDTA/HEPES/DPBS-Puffer einmal auf und ab pipettieren und dann mit der vorbefeuchteten Pipette das Gewebe und die Puffersuspension 20 Mal verreiben, um die Epithelschleimhaut zu entfernen.

Sammeln Sie das Gewebe, indem Sie die Mischung durch ein 100-Mikron-Nylon-Zellsieb gießen, und legen Sie das im Sieb zurückgehaltene Gewebe mit einer Nadelzange in ein neues konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 30 Millilitern eiskaltem EDTA/HEPES/DPBS. Wiederholen Sie die EDTA/HEPES/DPBS-Inkubation ein zweites Mal, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit etwa 60 Neigungen pro Minute schaukeln, um zusätzliche Epithelschleimhaut zu entfernen.

Führen Sie eine sanfte Verreibung mit einer vorangefeuchteten 5-Milliliter-Pipette durch. Das Gewebe neigt dazu, an der Innenseite der Pipette zu kleben, wenn mehr Epithel entfernt wird.

An dieser Stelle ist eine sanfte Verreibung erforderlich, da die enterischen Gliazellen empfindlicher sind.

Sammeln Sie das Gewebe nach der zweiten Inkubation, indem Sie die Mischung durch ein 100-Mikron-Nylon-Zellsieb gießen, und verwerfen Sie den Durchfluss. Der zweite Durchfluss sollte deutlich weniger trüb sein als der erste. Wiederholen Sie die 10-minütigen EDTA-Inkubationen, bis die Lösung nahezu klar ist.

Übertragen Sie das Gewebe aus dem Nylonsieb in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 5 Milliliter der im Handel erhältlichen Zellrückgewinnungslösung enthält. Dann 25 bis 30 Minuten bei 4 Grad Celsius schaukeln. 10 Mal vorsichtig trituieren, um die enterischen Gliazellen von der Lamina propria zu dissoziieren, dann filtrieren Sie durch einen 40-Mikron-Filter und sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie das Tuch auf dem Nylonfilter mit 1 Milliliter DPBS ab. Entsorgen Sie das Gewebe und geben Sie die 5 bis 6 Milliliter Filtrat in ein sauberes konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Schleudern Sie das Filtrat bei 2.000 g in einer schwingenden Eimerzentrifuge für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius.

Resuspendieren Sie das Gliazellen-haltige Pellet in mindestens 1 Milliliter Resuspensionspuffer, indem Sie das Pellet mit der 500-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Blasen einzuführen. Schließlich werden die enterischen Gliazellen plattiert, indem 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer mit Laminin beschichteten 6-Well-Platte oder 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte, die Gliawachstumsmedien enthält, gegeben werden.

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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026