Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Beginnen Sie mit einem kalten Glasmörser, der kortikales Hirngewebe von Ratten enthält, das die äußerste Schicht des Gehirns ist.

Fügen Sie einen Gehirn-Mikrogefäßpuffer oder BMB hinzu, der Proteaseinhibitoren enthält.

Bewegen Sie nun den Stößel auf und ab, um das Gewebe zu dissoziieren.

Diese Bewegung setzt die neurovaskulären Einheiten (NVUs) frei, die aus Mikrogefäßen, Perizyten, Neuronen und Gliazellen bestehen. Die Proteasehemmer blockieren die freigesetzten Proteasen und schützen so die Mikrogefäße.

Gib diese Mischung in ein Röhrchen.

Fügen Sie eine dichte Polysaccharidlösung hinzu. Verwenden Sie einen Wirbel, um die Lösung gleichmäßig mit dem anderen Inhalt zu vermischen.

Zentrifuge. Die dichten Polysaccharide ermöglichen die Sedimentation von NVUs, die dichter sind als Gewebetrümmer.

Der Überstand ist zu verwerfen und die NVUs in BMB, das den Proteaseinhibitor und die Polysaccharidlösung enthält, zu resuspendieren.

Verwenden Sie den Vortex, um den Inhalt zu mischen.

Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang. Entsorgen Sie den Überstand, um alle Rückstände zu entfernen.

Unterbrechen Sie die NVUs in BMB erneut, und speichern Sie sie für die weitere Analyse.

Legen Sie das kortikale Hirngewebe in einen gekühlten Glasmörser. Fügen Sie dann 5 Milliliter BMB mit Proteasehemmer-Cocktail hinzu. Führen Sie mit einem Überkopf-Homogenisator einen Stößel in den Mörser ein und homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 Auf- und Abbewegungen bei 3.700 U/min. Gießen Sie dann das Homogenat in beschriftete Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie zwischen den Proben 70 % Ethanol, um den Stößel zu reinigen.

Um die Zentrifugation durchzuführen, geben Sie 8,0 Milliliter 26%ige Dextranlösung in jedes markierte Zentrifugenröhrchen, das das Gehirnhomogenat enthält. Drehen Sie das Röhrchen zweimal um und wirbeln Sie die Probe dann gründlich durch. Führen Sie das Vortexen jeder Probe aus mehreren Winkeln durch, um ein gründliches Mischen der Gehirnhomogenatlösung mit 26 % iger Dextranlösung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 g und 4 Grad Celsius für 15 Minuten.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5,0 Millilitern BMB mit Proteasehemmer-Cocktail. Wirbeln Sie dann das Pellet vortexen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Geben Sie anschließend 8,0 Milliliter 26 % Dextran in jedes Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es vor, wie gerade gezeigt. Zentrifugieren Sie die Proben dann erneut.

Aspirieren Sie den Überstand mit einem Isolierkolben und einer Glaspipette und stellen Sie sicher, dass das Pellet, das das Mikrogefäß des Gehirns enthält, nicht zerstört wird. Resuspendieren Sie das Pellet in BMB mit Proteaseinhibitor und dann noch zwei weitere Male mit 26 % Dextran. Nach der abschließenden Zentrifugation geben Sie 5,0 Milliliter BMB zu jedem Pellet und Vortex, um die Probe wieder zu suspendieren.