Eine Technik zur Gewinnung und Dissoziation von Spinalganglien für neuronale Kulturen

Nimm einen Abschnitt der Wirbelsäule einer Ratte und teile ihn, um das Rückenmark zu entfernen.

Trennen Sie die Spinalganglien oder DRGs, eine Ansammlung von Neuronen, die von Satelliten-Gliazellen (SGCs) umgeben sind.

Lege die DRGs in ein Wachstumsmedium. Entfernen Sie die Nervenwurzeln, um die SGC-Kontamination zu reduzieren.

Mit Kollagenase behandeln, um die Gewebematrix abzubauen, und waschen, um die Enzyme zu entfernen.

Führen Sie Trypsin ein, um interzelluläre Verbindungen zu stören. Fügen Sie ein Serum hinzu, das Proteine enthält, die Trypsin deaktivieren.

Fügen Sie das Wachstumsmedium hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch. Filtern Sie die Suspension, um einzelne Zellen zu isolieren, und zentrifugieren Sie, um Gewebeablagerungen zu entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen, um sie auf einem Dichtegradientenmedium zu schichten, und zentrifugieren Sie.

Neuronen mit einer höheren Dichte siedeln sich am Boden an, was die Trennung von SGCs erleichtert.

Resuspendieren Sie die Neuronen in einem Kulturmedium. Übertragen Sie sie in eine mit Kultursubstrat beschichtete Vertiefung, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.

Ergänzung mit Nervenwachstumsfaktoren für das neuronale Überleben.

Um die DRG-Neuronen nach der Entnahme des Rückenmarks zu erhalten, beginnen Sie mit der Entfernung aller dorsalen Teile und verwenden Sie dann eine sterile und scharfe chirurgische Schere, um die Wirbelsäule entlang der Längsachse in zwei Hälften zu teilen und das Rückenmarksgewebe freizulegen. Schneiden Sie die Wirbelsäule unterhalb des Brustkorbs in zwei kleinere Segmente und entfernen Sie dann mit einer feinen Pinzette vorsichtig das gesamte Nabelschnurgewebe, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht an den DRG-Wurzeln ziehen und diese entfernen, die als weiße Filamente direkt aus den Kanälen kommen.

Wenn das gesamte Kerngewebe entfernt wurde, ziehen Sie mit einer sehr feinen Pinzette die gesamte DRG-Wurzel tief in die Wirbelkanäle und achten Sie darauf, die Wurzeln der Ganglien nicht zu beschädigen. Geben Sie das DRG in eine 60 Quadratmillimeter große Petrischale, die 3 bis 4 Milliliter des F-12-Mediums von Ham, ergänzt mit Antibiotika, enthält. Verwenden Sie dann unter einem Präpariermikroskop eine sterile Pinzette und ein Skalpell, um überschüssige Nervenwurzeln, die die Ganglien umgeben, zu entfernen, um die Kontamination der Satellitenzellen zu reduzieren.

Als nächstes geben Sie das DRG in eine 35 Quadratmillimeter große Petrischale, die 1,8 Milliliter frisches F-12-Medium enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter Kollagenase-Typ-4-Stammlösung hinzu. Inkubieren Sie das DRG eine Stunde lang und saugen Sie das Medium dann vorsichtig mit einer Glaspipette an, wobei Sie darauf achten müssen, dass das DRG nicht aspiriert oder beschädigt wird.

Wiederholen Sie den Kollagenase-Schritt und waschen Sie das DRG mit F-12 Medium. Geben Sie nach dem zweiten Waschen 1,8 Milliliter F12-Medium und 200 Mikroliter Trypsin zu den Zellen, entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie 1 Milliliter Medium hinzu, das mit 500 Mikrolitern FBS ergänzt wird, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Saugen Sie dann das Medium ab und waschen Sie das DRG dreimal vorsichtig mit F-12 Medium, um alle Spuren des Serums zu entfernen.

Füttern Sie nun die Zellen mit 2 Millilitern frischem F-12-Medium und geben Sie die Zellsuspension mit einer Glaspipette vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie 8 bis 10 Mal auf und ab, um die Neuronen sanft zu dissoziieren, und lassen Sie dann zu, dass sich das Kügelchen am Boden des Röhrchens ansammelt. Wenn das Pellet abgesetzt ist, überführen Sie den Überstand in ein neues Rohr und fügen Sie dem Pellet 2 Milliliter frisches F12-Medium hinzu, wobei die mechanische Dissoziation und der Medientransfer wiederholt werden, bis die Suspension homogen wird.

Dann trituieren Sie die Zellsuspension drei- bis viermal, gefolgt von der Filtration der resultierenden homogenisierten Suspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Während sie sich drehen, pipettieren Sie frisch zubereitetes 15%iges Rinderserumalbumin langsam durch die Innenseite eines 15-Milliliter-Röhrchens, das in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um eine allmähliche Proteinspur zu erzeugen, wobei die Zahlen auf dem Röhrchen als Referenz für die Formspur dienen.

Saugen Sie dann den Überstand aus den Zellen ab, sparen Sie die letzten 500 Mikroliter für die Resuspendierung des Pellets und geben Sie die Zellen entlang der Proteinspur langsam in das neue Röhrchen ab. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter modifiziertem BS-Medium und säen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen Medium in einer 24-Well-Platte für zwei Stunden aus. Wenn sich die Zellen anheftet haben, fügen Sie frisches BS-Medium hinzu, das mit 50 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor ergänzt ist.