Isolierung und Kultivierung von zerebralen Perizyten der Maus

Fügen Sie dem Gehirngewebe der Maus Puffer hinzu und homogenisieren Sie es, um Zellen und Mikrogefäße freizusetzen.

Geben Sie anschließend die BSA-Dextran-Lösung zum Homogenat. Mischen und zentrifugieren, um die Komponenten zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie die Mikrogefäße wieder in Puffer und leiten Sie sie durch einen Filter, wobei Sie größere Gefäße entfernen.

Zentrifugieren Sie nun das Filtrat und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Mikrogefäße in Puffer, der DNAsen enthält.

Fügen Sie proteolytische Enzyme hinzu, um Endothelzellen und Perizyten freizusetzen.

DNasen bauen DNA ab.

Fügen Sie BSA-haltigen Puffer hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen. Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Zellen in Medien und plattieren Sie sie auf einer mit Basalmatrix beschichteten Multiwell-Platte. Inkubieren und fördern die Zelladhäsion.

Wechseln Sie regelmäßig das Medium.

Endothelzellen bilden eine Monoschicht und unterstützen das Wachstum der Perizyten.

Die anschließende Zellpassage in Perozytenmedien auf einer gelatinebeschichteten Multiwell-Platte fördert das Perinozytenwachstum und eliminiert gleichzeitig Endothelzellen.

Beginnen Sie damit, das Gehirn einer spezifischen, pathogenfreien männlichen C57 Black 6-Maus auf ein steriles, trockenes, fusselfreies Tuch zu legen und mit einer Pinzette mit gebogener Spitze das Kleinhirn, das Striatum und die Okzipitalnerven zu entfernen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um alle sichtbaren Hirnhäute zu entfernen, und stellen Sie das Hirngewebe auf den Kopf. Öffnen Sie die Lappen mit leichten Bewegungen nach außen und entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße. Legen Sie dann das meningenfreie Hirngewebe in eine 100-Millimeter-Petrischale, die 15 Milliliter kalten Waschpuffer B enthält.

Um das Gewebe zu homogenisieren, geben Sie die Gehirnprobe in ein Mörserröhrchen von Dounce Tissue Grinder und geben Sie 3 bis 4 Milliliter Waschpuffer B in das Röhrchen. Verwenden Sie einen losen Stößel, um das Taschentuch 55 Mal zu zerkleinern. Spülen Sie dann den Stößel mit Waschpuffer B ab und zerkleinern Sie die Gewebeaufschlämmung 25 Mal mit einem festen Stößel. Am Ende der Homogenisierung wird die Aufschlämmung gleichmäßig zwischen zwei 50-Milliliter-Röhrchen aliquotiert und das 1,5-fache Volumen an kaltem 30%igem Rinderserumalbumin Dextran zugegeben. Schütteln Sie dann die Röhrchen kräftig, um die Aufschlämmung zu mischen.

Um die Gefäßfraktion zu isolieren, sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und überführen Sie die Überstände in zwei neue Röhrchen. Lagern Sie das Pellet im Waschpuffer B auf Eis. Suspendieren Sie die Pellets in drei Millilitern Kaltwaschpuffer B auf Eis.

Zentrifugieren Sie die geernteten Überstände und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Entsorgen Sie die Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 3 Millilitern Waschpuffer B. Poolen Sie dann die resuspendierten Pellets und bringen Sie das endgültige Volumen der gepoolten Zellsuspensionen auf 10 Milliliter mit frischem kaltem Waschpuffer B.

Dissoziieren Sie die Zellen mit einer 10-Millimeter-Pipette sechsmal, bis keine verbleibenden Pelletklumpen mehr sichtbar sind, und verwenden Sie eine Vakuumfilteranordnung und ein Nylonnetzsieb, um die Zellsuspension zu filtern. Legen Sie das Sieb in eine Petrischale und reinigen Sie das Netz mit frischem Waschpuffer B und kratzen Sie, um alle Kapillaren zu entfernen. Führen Sie dann eine zweite Filtration mit einem frischen Filter durch.

Das Filtrat gleichmäßig auf zwei Röhrchen verteilen und die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Nachdem Sie die Überstände verworfen haben, poolen Sie die Pellets in ein einzelnes Röhrchen mit vorgewärmtem Waschpuffer B mit Enzymen und geben Sie vorgewärmte Kollagenasedispase in das Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen für genau 33 Minuten bei 37 Grad Celsius in ein Schütteltisch-Wasserbad, bevor Sie die Reaktion mit 30 Millilitern kaltem Waschpuffer B stoppen.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Schnell, aber vorsichtig das Granulat im Waschpuffer B sechsmal resuspendieren und die Suspension erneut zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands resuspendieren Sie das Pellet in Millilitern vollständigem DMEM-Medium und säen Sie 2 Milliliter Zellsuspension in vollständigem DMEM in neun Vertiefungen mit drei Matrigel-beschichteten Sechs-Well-Platten.

Legen Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang in einen sterilen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Rückstände vorsichtig aus jeder Vertiefung entfernen und frisches DMEM-Medium hinzufügen. Wechseln Sie nach 48 Stunden das Medium in jeder Vertiefung alle 48 Stunden. An den Tagen 8 bis 10, wenn die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen, werden die Zellen im Parasitenkulturmedium auf neue, mit Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platten geleitet und die Zellen für weitere 6 bis 7 Tage unter Überwachung in den Zellkultur-Inkubator zurückgebracht.