$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Beginnen Sie mit einem murinen Gehirn mit neuralen, nicht-neuralen und Immunzellen in der extrazellulären Matrix oder EZM des Gehirns.
Zerkleinern Sie das Gewebe und resuspendieren Sie es in einem Nährmedium.
Übertragen Sie diese Gewebefragmente in ein Röhrchen und behandeln Sie sie mit Kollagenase und DNase-I-Enzymen.
Kollagenase verdaut die EZM und setzt einzelne Zellen frei, während DNase-I freie DNA abbaut, um Zellverklumpungen zu verhindern.
Fügen Sie dann EDTA hinzu, um die Kollagenase-Enzyme zu inaktivieren.
Fügen Sie einen Nährboden hinzu. Zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Geben Sie eine Dichtegradientenlösung und das Kulturmedium zum Zellpellet, wodurch eine Gradientenschicht mit geringer Dichte entsteht.
Mischen Sie die Lösung und unterlegen Sie sie dann mit einer Gradientenlösung mit hoher Dichte, um einen Dichteunterschied herzustellen.
Zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit, um Immunzellen an der Grenzfläche zu trennen, mit leichteren Zelltrümmern oben und schwereren neuronalen und Gliazellen unten.
Entfernen Sie die obere Schicht, sammeln Sie die Immunzellen und übertragen Sie sie in ein anderes Röhrchen.
Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Medium, um eine einzellige Suspension für nachgeschaltete Anwendungen zu bilden.
Gießen Sie das Gehirn- oder Rückenmarksgewebe mit dem Medium in eine 100-Millimeter-Petrischale und befördern Sie das Gewebe mit einer Pinzette nach unten. Zerkleinern Sie das Hirngewebe mit einer sterilen Rasierklinge und sammeln Sie das Gewebe am Boden der Platte. Geben Sie 3 Milliliter RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, in die Petrischale, verwenden Sie dann eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um das Gewebe im Medium zu resuspendieren und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.
Geben Sie Kollagenase Typ I und DNase I in das Gewebe und inkubieren Sie die Röhren in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 40 Minuten. Drehen Sie die Röhren alle 15 Minuten um, um das Gewebe gründlich mit den Enzymen zu vermischen. Geben Sie nach der Inkubation EDTA in jedes Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,01 molar und inkubieren Sie die Röhrchen weitere fünf Minuten lang, um die Kollagenase zu inaktivieren.
Geben Sie 9 Milliliter RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 450 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einem Vakuum, um den Überstand abzusaugen, und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren.
Geben Sie 3 Milliliter 100% isotonische Stammdichtegradientenlösung zum Zellpellet. Fügen Sie dann zusätzliches RPMI 10 % FCS-Medium hinzu, um das endgültige Volumen auf 10 Milliliter zu bringen, und resuspendieren Sie das Zellpellet. Den Schlauch umdrehen und gut mischen. Führen Sie dann eine serologische Pipette mit 1 Milliliter 70%iger isotonischer Stamm-Dichtegradientenlösung in den Boden des Röhrchens ein.
Lege die Lösung langsam unter und achte darauf, dass keine Blasen entstehen. Nehmen Sie die serologische Pipette aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius und aspirieren Sie dann den Überstand einschließlich der Myelin-Trümmerschicht, bis 2 bis 3 Milliliter im Röhrchen verbleiben.
Verwenden Sie eine 1-Milliliter-Pipette, um die Zellschicht zwischen dem Dichtegradienten von 30 % und 70 % zu ernten und in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Fügen Sie RPMI 10% FCS-Medium hinzu, um das Endvolumen auf 15 Milliliter zu bringen, und zentrifugieren Sie die Zellen dann 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 450 g.