Analyse der Reaktivierung neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten

Als Reaktion auf äußere Reize verlassen die neuralen Stammzellen (NSCs) des Gehirns von Drosophila die Ruhe, einen Zustand des Zellzyklusstillstands, und reaktivieren, um mit der Proliferation zu beginnen.

Nehmen wir zum Beispiel frisch geschlüpfte Drosophila-Larven, ein Stadium, in dem NSCs in vivo auf natürliche Weise die Ruhephase verlassen.

Fassen Sie die Maulhaken und den Körper, um die Larve zu spalten.

Lokalisieren Sie das Gehirn hinter den Mundhaken und entfernen Sie es.

Übertragen Sie das Gehirn in Kulturplattenvertiefungen, die Medien enthalten.

In behandelten Vertiefungen enthält das Medium ein Testhormon, während in Kontrollvertiefungen das Hormon fehlt. Ausbrüten.

Unter Kontrollbedingungen bleiben die NSCs aufgrund des Fehlens äußerer Reize ruhig.

In behandelten Vertiefungen bindet das Hormon an spezifische NSC-Rezeptoren, aktiviert nachgeschaltete Signalwege und reaktiviert die NSCs.

Die reaktivierten NSCs gelangen in den Zellzyklus und vermehren sich.

Nach der Inkubation sind die Gehirne nun bereit für die nachgelagerte Analyse, um die NSC-Proliferation zu visualisieren und das Reaktivierungspotenzial des Hormons zu bestätigen.

Präparieren Sie die Gehirne aus den Larven, die in die zweite gläserne Uhrenschale gelegt wurden, mit SSM mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop und passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf an. Greifen Sie mit einer Pinzette nach den Mundhaken, mit der anderen greifen Sie den Körper vorsichtig auf halber Höhe und ziehen Sie in die entgegengesetzte Richtung, um die Larve in zwei Teile zu teilen. Nach dem Präparieren von 15 bis 20 Gehirnen geben Sie 1 Milliliter SSM in eine Vertiefung eines sterilen 24-Well-Kulturtabletts. Mit einer Mikropipette und einer sterilen Spitze werden die frisch präparierten Gehirne in das SSM überführt, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation des Mediums mit Gehirnen bei 25 Grad Celsius.