Isolierung von Schwann-Zellen aus spinalen Wurzeln der Maus

Nehmen Sie eine Nervenwurzel und hacken Sie sie in kleine Stücke.

In ein Verdauungsenzym-haltiges Röhrchen umfüllen und inkubieren.

Das Enzym verdaut die extrazelluläre Matrix.

Fügen Sie Medien mit Serum hinzu, um die Verdauung zu stoppen.

Pipettieren Sie den Inhalt wiederholt, zentrifugieren Sie dann und entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet erneut.

Führen Sie die Suspension durch ein Sieb, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Inkubieren Sie die gesammelten Zellen in einer Platte.

Fibroblasten- und Schwann-Zellen oder SCs heften sich an die Platte und teilen sich.

Entfernen Sie die nicht angehängten Zellen. Waschen Sie die anhaftenden Zellen mit einem Phosphatpuffer.

Fügen Sie Verdauungsenzyme hinzu, um die verdauungsempfindlichen SCs zu lockern. Stoppen Sie die Verdauung mit Medien.

Trennen Sie SCs vollständig, indem Sie Medien hinzufügen.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in SC-spezifischen Medien.

Übertragen Sie die Zellen auf eine unbeschichtete Platte und inkubieren Sie.

Alle verbleibenden Fibroblasten haften an und lassen die SCs in Suspension.

Übertragen Sie die Suspension auf eine matrixbeschichtete Platte.

Inkubieren für die Anheftung und Teilung von Schwann-Zellen.

Schneide die Nerven mit einer Schere in 3 bis 5 Millimeter große Stücke. Fügen Sie 1 Milliliter 0,25 % Trypsin hinzu und übertragen Sie die Nervenstücke in 5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Minuten. Um die Verdauung zu stoppen, fügen Sie anschließend 3 bis 4 Milliliter DMEM hinzu, die 10 % fötales Rinderserum enthalten. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, etwa 10 Mal. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 mal g.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und der Niederschlag in 2 bis 3 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, resuspendiert. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 400-Mesh-Filter und verwenden Sie die Suspension dann, um eine 60-Millimeter-Petrischale zu impfen. Inkubieren Sie die Petrischalen 4 bis 5 Tage lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid.

Wenn die Kultur eine Konfluenz von 90 % erreicht hat, waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS. Um die Schwann-Zellen zu verdauen, fügen Sie dann 1 Milliliter 0,25 % Trypsin bei 37 Grad Celsius pro 60-Millimeter-Schale hinzu. Nach 8 bis 10 Sekunden bei Raumtemperatur stoppen Sie den Aufschluss, indem Sie 3 Milliliter DMEM hinzufügen, das mit 10 % FBS ergänzt ist. Um die Schwann-Zellen zu lösen, blasen Sie mit einer Pipette vorsichtig auf die Zellen.

Überprüfen Sie mit dem Mikroskop, ob die Zellen abgelöst sind. Sammeln Sie dann das Medium, das die Schwann-Zellen enthält, und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g. Den Überstand verwerfen und den Niederschlag in 3 Millilitern Medium resuspendieren. Verwenden Sie die Suspension, um uncodierte 60-Millimeter-Petrischalen zu impfen, und inkubieren Sie die Schalen 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie das Medium, das die Schwann-Zellen enthalten wird, in eine mit Poly-L-Lysin beschichtete Mediumschale und inkubieren Sie die Schale 2 Tage lang bei 37 Grad Celsius.