Markierung von Oberflächenmarkern neuraler Zellen mit Azidozucker während der Co-Kultivierung mit Endothelzellen

Beginnen Sie mit der Zugabe einer Endothelzellsuspension des Mausgehirns zum permeablen Membraneinsatz einer Transwell-Platte.

Geben Sie ein Wachstumsmedium gut auf den Boden und inkubieren Sie.

Die Wachstumsfaktoren und Nährstoffe im Medium helfen den Zellen, als Monoschicht zu wachsen.

Entfernen Sie das Medium aus der unteren Mulde und aus der Einlage.

Waschen Sie die Innen- und Außenflächen des Einsatzes, um Schmutz zu entfernen.

Geben Sie ein adhärentes Medium in den Einsatz und übertragen Sie den Einsatz in eine matrixbeschichtete Vertiefung, die primäre kortikale neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) enthält, und inkubieren Sie.

Fügen Sie sowohl den Endothelzellen als auch den NSPCs Azidozucker, ein unnatürliches Sialinsäure-Vorläuferanalogon, hinzu und inkubieren Sie.

Die von Endothelzellen sezernierten Zytokine und Chemokine fördern das Wachstum von NSPCs zu großen blattartigen Klonen.

Azidozucker integrieren sich in die Sialglykanstrukturen auf der NSPC-Zelloberfläche und markieren das Glykoprotein. Dies ermöglicht die Identifizierung von Zelloberflächenproteinen auf den expandierten NSPCs.

Um die Endothelzellen vorzubereiten, resuspendieren Sie ein BEND3-Zellpellet aus einer 0,10 Zentimeter großen Petrischale bei 90 % Konfluenz mit 9 Millilitern BEND3-Zellmedium. Geben Sie 1 Milliliter der Zellsuspension in eine durchlässige Stützeinlage. Geben Sie weitere 2 Milliliter BEND3 medium pro Vertiefung in die untere Kammer der Matrix. Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Einen Tag nach dem Plattieren der Zellen in den Einsätzen wird das Medium vorsichtig abgesaugt, zuerst aus der unteren Kammer und dann aus den Einsätzen. Waschen Sie die Vorderseite der Einlagen dreimal mit vorgewärmtem DMEM. Waschen Sie die Außenfläche der Einlagen, indem Sie sie mit vorgewärmtem DMEM abspülen. Geben Sie anschließend 1 Milliliter vorgewärmtes AM in eine Einlage. Übertragen Sie die Inserts in die Vertiefungen mit den primären kortikalen Zellen. Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 12 Stunden.

Ac₄ManNAz wird in DMSO gelöst, um eine Stammkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen. Entnehmen Sie die neuronale endotheliale Co-Kulturplatte aus dem Inkubator. Geben Sie 1 Mikroliter des Ac₄ManNAz-Stamms in jede untere Kammer und 0,5 Mikroliter pro Einsatz in die Co-Kultur. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 5 Tage. Während die Zellen kultivieren, fügen Sie 100 Mikroliter RM pro Einsatz und 200 Mikroliter RM pro Bodenkammer hinzu, um die Endothel- und Nervenzellen jeden zweiten Tag neu zu füttern.