Generierung eines pro-inflammatorischen Organkulturmodells zur Simulation einer frühen Bandscheibenerkrankung

Nehmen Sie einen Rinderschwanz.

Entfernen Sie das darüber liegende Gewebe und die Wirbelfortsätze und schneiden Sie dann quer, um Segmente zu erhalten.

Identifizieren Sie die Bandscheibe oder IVD, die sich zwischen den Wachstumsfugen und den Wirbelendplatten befindet.

Schneiden Sie auf beiden Seiten des IVD und legen Sie es in eine Schale mit Gaze, die in Puffer getränkt ist, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.

Kratzen Sie anhaftendes Wirbelgewebe ab und messen Sie die IVD-Höhe.

Waschen Sie mit einem Puffer, um Blutreste zu entfernen, und desinfizieren Sie das IVD in einem Puffer, der Antibiotika enthält.

Legen Sie die IVDs in Bioreaktorkammern mit Medien.

Das Medium in der physiologischen Gruppe hat einen hohen Glukosegehalt, während in der pathologischen Gruppe ein Medium mit niedrigem Glukosegehalt einen Nährstoffmangel induziert.

Stellen Sie die Kammern in den Bioreaktor.

Für die physiologische IVD täglich eine sanfte Belastung anwenden. Für die pathologische IVD wenden Sie täglich eine intensive Belastung mit einer höheren Rate an.

Lassen Sie die IVDs zwischen den täglichen Belastungstests in Medien erholen.

Messen Sie nach allen Ladevorgängen die IVD-Höhen.

Eine verminderte Körpergröße bei den pathologischen IVDs deutet auf einen degenerativen und proinflammatorischen Zustand hin.

Beginnen Sie damit, den gesamten Rinderschwanz gründlich mit Leitungswasser zu spülen, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen. Tauchen Sie dann den Schwanz 10 Minuten lang in 1%ige Betadinlösung, um die Oberfläche zu desinfizieren. Verwenden Sie ein Skalpell Nummer 20, um das Weichgewebe von der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der Bandscheiben oder IVDs zu erleichtern.

Entfernen Sie die Dorn- und Querfortsätze der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange. Schneiden Sie mit einer Knochenzange quer durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um einzelne Bewegungssegmente zu erhalten, und legen Sie dann die gesammelten Bewegungssegmente mit einer in Ringers Lösung benetzten Gaze in eine Petrischale.

Lokalisieren Sie das IVD und die Wirbel, indem Sie die Bewegungssegmente vorsichtig bewegen. Identifiziere dann die Position der Wachstumsfuge, indem du die konvexe Seite der knöchernen Endplatte berührst und fängst. Kühlen Sie das Sägeblatt der Bandsäge mit der Ringer-Lösung ab und machen Sie damit zwei parallele Schnitte in der Wachstumsfuge der IVDs, einen auf jeder Seite.

Übertragen Sie die IVDs in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze, die mit Ringer-Lösung benetzt ist. Kratzen Sie den Wirbelkörper und die Wachstumsfuge mit der Skalpellklinge ab, wobei die Endplatte intakt bleibt. Positionieren Sie die beiden Oberflächen flach und parallel für den Ladevorgang und geben Sie die abgeschabten IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringer-Lösung benetzt ist.

Messen Sie die Höhe und den Durchmesser der Scheibe mit einem Messschieber. Reinigen Sie dann die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit der Ringer-Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems. Desinfizieren Sie IVDs in PBS und 10% Penicillin-Streptomycin unter Schütteln für 15 Minuten. Spülen Sie die hochkonzentrierten Antibiotika mit PBS und 1% Penicillin-Streptomycin ab.

Übertragen Sie die Discs in IVD-Kammern mit 5 Millilitern IVD-Kulturmedium und legen Sie sie in das Bioreaktorsystem mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 85 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid. Kultivieren Sie die Scheiben vier Tage lang in einem Bioreaktorsystem, indem Sie je nach Versuchsgruppe unterschiedliche Belastungsbedingungen aufrechterhalten.

In der physiologischen Kontrollgruppe kultivieren Sie die IVDs mit hohem Glukosemedium unter Verwendung eines Beladungsprotokolls von 0,02 bis 0,2 Megapascal und 0,2 Hertz für zwei Stunden pro Tag. In der pathologischen Gruppe kultivieren Sie die IVDs mit niedrigem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,32 bis 0,5 Megapascal und 5 Hertz für zwei Stunden pro Tag.

Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit 7 Millilitern IVD-Kulturmedium, um die Quellung frei wiederherzustellen. Messen Sie die Scheibenhöhe täglich mit einem Messschieber nach der freien Quellphase und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer.