Magnetische Trennung von Schwann-Zellen von Ischiasnerven der Maus

Nehmen Sie eine Suspension von Zellen und Trümmern aus enzymatisch verdauten Ischiasnervenfasern der Maus.

Durch ein Sieb passieren und Schmutz entfernen.

Das Filtrat zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in serumhaltigen Medien und säen Sie sie auf eine mit Adhäsionsproteinen beschichtete Kulturplatte.

Inkubieren für die Zelladhäsion. Ersetzen Sie das Medium durch Schwann-Zellmedien. Inkubieren für die Bildung von Schwann-Zell-Monolagen.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit Puffer. Inkubieren Sie mit Trypsin, um Zellen abzulösen.

Fügen Sie serumhaltige Medien hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.

Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in Puffer und fügen Sie antikörperbeschichtete magnetische Mikrokügelchen hinzu.

Inkubieren, um Antikörper an Fibroblasten-Glykoproteine zu binden.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Suspendieren Sie die Zellen wieder in einem Puffer und laden Sie sie in eine magnetische Trennsäule mit ferromagnetischen Kugeln, die im Magnetfeld des Magnetabscheiders platziert sind.

Das Magnetfeld hält die Mikrokügelchen-gebundenen Fibroblasten zurück, so dass Schwann-Zellen im Durchfluss gesammelt werden können.

Die verdauten Nerven werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, um sie bei 188 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius zu zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in 10 Millilitern DMEM mit 10 % FCS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin resuspendiert.

Filtrieren Sie anschließend die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb. Nach dem Zentrifugieren bei 188 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius wird das Pellet mit 4 Millilitern DMEM, das FCS und Gentamicin enthält, resuspendiert. Geben Sie je 2 Milliliter der Zellsuspension in eine der beiden mit Poly-L-Lysin und Laminin beschichteten 60-Millimeter-Gewebekulturschalen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und lassen Sie die Platten 2 Tage lang unberührt im Inkubator.

Zentrifugieren Sie die Schwann-Zellsuspension bei 188 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikrolitern magnetischem Zellseparationspuffer pro 1 x 10⁷ Zellen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter Thy-1 Mikrokügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen hinzu. Inkubieren Sie die resuspendierte Lösung 15 Minuten lang im Dunkeln bei 8 Grad Celsius.

Geben Sie anschließend 2 Milliliter des magnetischen Zelltrennpuffers in die Zellsuspension. Nach dem Zentrifugieren bei 300 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius wird das Pellet in 500 Mikrolitern magnetischem Zelltrennpuffer resuspendiert. Setzen Sie die magnetische Zelltrennsäule in den Zellseparator ein und befeuchten Sie die Säule mit 1 Milliliter des magnetischen Zelltrennpuffers. Wenden Sie dann die Zellen darauf an, um den Durchfluss zu sammeln.